摘要 采用生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定了遼細(xì)辛根的不同溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)粗提取物和精油對(duì)引起黃瓜灰霉病的灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的作用。結(jié)果表明，細(xì)辛不同溶劑提取物和精油對(duì)灰葡萄孢菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，且對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果好于對(duì)其菌絲生長(zhǎng)的抑制效果；石油醚提取物和精油的抑菌效果較好，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的EC₅₀分別為177.44 mg/L。和159.98 mg/L，對(duì)孢子萌發(fā)的EC₅₀分別為173.23 mg/L和125.29 mg/L；試驗(yàn)還顯示細(xì)辛所含的主要抑菌活性成分易被極性小的有機(jī)溶劑所提取。

關(guān)鍵詞 細(xì)辛；灰葡萄孢菌；生長(zhǎng)速率法；孢子萌發(fā)法；抑菌活性

中圖分類號(hào) S482.292

1962年，美國(guó)作家R.Carson采用夸張的手法在《寂靜的春天》一書中將化學(xué)農(nóng)藥使用所導(dǎo)致的副作用和存在的問題推向了輿論的前沿。農(nóng)藥的使用所導(dǎo)致的社會(huì)和生態(tài)問題受到人們的日益關(guān)注，化學(xué)農(nóng)藥的使用和作用遭到人們的普遍質(zhì)疑。植物源農(nóng)藥具有高效，低毒，無殘留，選擇性高，易與其他農(nóng)藥相混配，與環(huán)境和諧，符合現(xiàn)代環(huán)保和人們健康的要求等特點(diǎn)而越來越引起世界各國(guó)的重視，近幾年掀起了一個(gè)研究開發(fā)植物源農(nóng)藥的高潮。

遼細(xì)辛[Asarum heterotropoides Fr.Var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.]又名北細(xì)辛，為馬兜鈴科植物。細(xì)辛是重要的中藥，我國(guó)用藥歷史悠久，在2 000多年前就有用藥記載。細(xì)辛中揮發(fā)油成分(3％左右)是主要的抗菌物質(zhì)，主要含有甲基丁香酚、香酯素、黃樟醚、細(xì)辛醚等。為進(jìn)一步深入了解細(xì)辛提取物對(duì)植物致病菌的抑菌活性，評(píng)價(jià)細(xì)辛的藥物應(yīng)用價(jià)值和作為植物源農(nóng)藥的開發(fā)前景，本文以細(xì)辛精油及細(xì)辛不同溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)提取物為材料，初步研究其對(duì)黃瓜灰霉病病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用，為開發(fā)植物源殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 植物樣品及提取

以遼細(xì)辛根為材料進(jìn)行試驗(yàn)，樣品購自沈陽市中草藥市場(chǎng)，將其進(jìn)一步陰干，粉碎，40目過篩。

為了有效地提取活性物質(zhì)，選用極性不同的溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)組成一個(gè)溶劑系列，采用索氏提取器對(duì)樣品進(jìn)行6～8 h提取(60℃)。采用2種不同方法提取細(xì)辛。溶劑系列的平行提取(分別提取)：即準(zhǔn)確稱取樣品50 g，共4份，分別用300 mL石油醚、氯仿、乙酸乙酯和乙醇進(jìn)行索氏提取。溶劑系列的分步提取(順序提取)：即準(zhǔn)確稱取樣品120 g，用該系列溶劑對(duì)其依順序進(jìn)行提取，先經(jīng)石油醚提取，其渣繼以氯仿提取，以此類推。所得各提取液抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，直到冷凝管中無溶劑滴下為止，回收溶劑，最后得到較濃油狀或漿狀的粗提取物，提取物稱重，計(jì)算提取率。密封，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)辛精油的提取：所用儀器為TC-SFE-42-5-120S超臨界萃取設(shè)備(沈陽天誠(chéng)超臨界萃取有限公司制造)。稱取樣品1.85 kg，裝入5 L的萃取罐內(nèi)，超臨界C02萃取：萃取壓力20 MPa，萃取溫度40℃，流量20 kg/h；解析釜I壓力6～7 MPa，溫度45℃；解析釜Ⅱ壓力5～6 MPa，溫度35℃，萃取時(shí)間為90min，每20 min收集1次提取物，稱量，密封，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 供試菌株

供試菌種為引起黃瓜灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.ex Fr.)，由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供。

1．3 藥液的配制

菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)藥液的配制：先將細(xì)辛不同溶劑提取物和精油用少許無水乙醇(不超過總體積的2％)充分溶解，用無菌水配制成12 000 mg/L的母液，然后用無菌水稀釋成12 000、6 000、3 000、1 500、750 mg/L 5個(gè)濃度梯度，備用。

孢子萌發(fā)試驗(yàn)藥液的配制：將細(xì)辛不同溶劑提取物和精油用二甲基亞砜配制成48 000、24 000、12 000、6 000、3 000 mg/L5個(gè)濃度梯度，備用。

1．4 生物測(cè)定方法

1．4．1 生長(zhǎng)速率法

以生長(zhǎng)速率法(瓊膠平板法)測(cè)定細(xì)辛不同溶劑提取物和精油對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，藥液終濃度分別為1 200、600、300、150、75 mg/L。菌餅直徑0.5 cm，每皿1塊，3次重復(fù)，(21±1)℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對(duì)照菌落直徑在3 cm以上時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。根據(jù)菌落直徑求抑制生長(zhǎng)的百分率，公式如下：

菌落生長(zhǎng)直徑＝兩次直徑平均值-0.5 cm；

菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑)/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100％。

1．4．2 孢子萌發(fā)法

以孢子萌發(fā)法(懸滴法)測(cè)定細(xì)辛不同溶劑提取物和精油對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用。以96孔微孔培養(yǎng)板代替凹槽載玻片。吸取孢子懸液78 uL與2 uL植物提取試驗(yàn)藥液混合使之達(dá)到規(guī)定濃度(藥液終濃度分別為1 200、600、300、150、75 mg/L)，以二甲基亞砜(2 uL+78uL無菌水)為空白對(duì)照，3次重復(fù)，12 h觀察結(jié)果，根據(jù)下列公式計(jì)算抑制率：

萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100％；

孢子萌發(fā)抑制率=(對(duì)照萌發(fā)率－處理萌發(fā)率)/對(duì)照萌發(fā)率×100％。

1．5 毒力回歸線的建立

取細(xì)辛的不同溶劑提取物和精油各適當(dāng)量，用水或二甲基亞砜等比稀釋成1 200、600、300、150、75 mg/L 5個(gè)系列濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次，建立毒力回歸方程。將抑菌的百分率轉(zhuǎn)換成幾率值，濃度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)，進(jìn)行幾率值分析，求出細(xì)辛不同溶劑提取物和精油對(duì)病原菌的抑制中濃度(EC₅₀)。

1．6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，經(jīng)DPSv3.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，線性回歸等由SPSS13完成。

2 結(jié)果與分析

2．1 供試植物樣品的提取率

遼細(xì)辛根采用超臨界CO₂法萃取精油和采用4種極性不同溶劑進(jìn)行索氏提取，除去溶劑蒸干后，各樣品的提取率如表1所示。

提取率的高低反應(yīng)了植物材料中溶于溶劑物質(zhì)的多少。從表1可以看出，進(jìn)行平行提取時(shí)，細(xì)辛根的不同溶劑提取物的提取率差異較小，石油醚的提取率較低，為4.08％；氯仿和乙醇的提取率較高，且很接近，在6.5％左右。進(jìn)行分步提取時(shí)，細(xì)辛根的不同溶劑提取物的提取率差異較大，石油醚的提取率最高，為4.08％；其次為以乙醇作溶劑，提取率為2.44％；乙酸乙酯和氯仿的提取率較低，分別為1.65％和1.79％。遼細(xì)辛根的精油采用超臨界C02提取，1.85 kg的原料共萃取得到42 g精油，提取率為2.27％。

2．2 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

在供試條件下，以生長(zhǎng)速率法測(cè)定了細(xì)辛精油及不同極性溶劑提取物對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，細(xì)辛不同提取物對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌效果均隨提取物濃度的增大而升高，在供試濃度下，表現(xiàn)出了較好的抑菌效果。

從平行提取結(jié)果看，當(dāng)濃度＜300 mg/L，菌落直徑抑制率均低于50％；當(dāng)濃度＞300 mg/L，菌落直徑抑制率均高于50％；濃度為300 mg/L，菌落直徑抑制率變化較大，石油醚提取物的抑菌效果最高，為60.58％，而乙醇提取物的抑菌效果只有31.37％；濃度為1 200 mg/L時(shí)，不同溶劑提取物對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌效果均超過91％，處理間差異沒有達(dá)到極顯著；當(dāng)濃度≤600 mg/L，各提取物對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌效果表現(xiàn)出極顯著的差異。

從分步提取結(jié)果看，在同一提取濃度下，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率均隨提取步驟的增加而降低。如當(dāng)濃度為1 200 mg/L時(shí)，石油醚提取物(第1步)的抑菌效果達(dá)到了100％，氯仿提取物(第2步)和乙酸乙酯提取物(第3步)的抑菌效果分別為50.26％和42.51％，而到第4步用乙醇提取時(shí)，其提取物的抑菌效果下降到27.01％。

比較細(xì)辛精油的抑菌效果可以看出，當(dāng)濃度≥300 mg/L，菌落直徑抑制率均高于65％；濃度為1 200 mg/L時(shí)，抑菌效果達(dá)到了100％?？傮w看，細(xì)辛精油的抑菌效果與石油醚提取物的抑菌效果相接近。

根據(jù)細(xì)辛提取物對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌效果，將抑菌的百分率轉(zhuǎn)換成幾率值，濃度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)，進(jìn)行幾率值分析，求出了細(xì)辛提取物對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度(EC₅₀)，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，細(xì)辛精油的抑制效果最好，EC₅₀和EC₉₀。分別為159.98 mg/L和318.28 mg/L(轉(zhuǎn)換成樣品干重的質(zhì)量濃度分別為7.05 mg/mL和14.02 mg/mL)；從平行提取結(jié)果看，4種極性不同溶劑提取物對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌中濃度在170～350 mg/L之間，其中石油醚提取物的抑菌效果較好，EC₅₀為177.44 mg/L(轉(zhuǎn)換成樣品干重的質(zhì)量濃度為4.35 mg/mL)，當(dāng)比較EC₉₀時(shí)，4種不同溶劑提取物對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果則表現(xiàn)出顯著差異：石油醚提取物的抑菌效果最好，EC₉₀為446.72 mg/L，其次為乙酸乙酯提取物，氯仿提取物和乙醇提取物的抑菌效果較差，EC₉₀均大于1 300 m4g/L；從分步提取結(jié)果看，隨著提取步驟的增加，提取物對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果降低，石油醚提取物(第1步)的抑制效果最好，EC₅₀和EC9。分別為172.44 mg/L和347.06 mg/L(轉(zhuǎn)換成樣品干重的質(zhì)量濃度分別為：4.23 mg/mL和8.51 mg/mL)；而乙醇提取物(第4步)的抑菌效果最差，EC₅₀和EC9。分別為2 904.2 mg/L和35 504 mg/mL(轉(zhuǎn)換成樣品干重的質(zhì)量濃度分別為：119.02 mg/mL和1 455.08 mg/mL)。

2．3 對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用

以孢子萌發(fā)法測(cè)定了供試樣品對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用，試驗(yàn)濃度下各處理的孢子萌發(fā)抑制率如表4所示。

由表4可知：細(xì)辛不同溶劑提取物和精油對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用也較好，變化趨勢(shì)與對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制作用的趨勢(shì)相同。從平行提取結(jié)果看，當(dāng)濃度為1 200 mg/L時(shí)，石油醚、氯仿和乙酸乙酯的提取物對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑菌效果均超過95％，但乙醇提取物的抑菌效果卻只為83.27％。從分步提取結(jié)果看，在同一提取濃度下，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率也均隨提取物的進(jìn)一步提取而降低。比較細(xì)辛精油的抑菌效果可以看出，在同一供試濃度下，其對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制率均高于其他溶劑提取物的抑制率。

根據(jù)細(xì)辛提取物對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑菌效果，求出了細(xì)辛提取物對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制中濃度(EC₅₀)，結(jié)果如表5所示。

從表5可以看出，細(xì)辛提取物對(duì)灰葡萄孢菌的孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用。細(xì)辛精油的抑制效果最好，EC₅₀和EC9。分別為125.29 mg/L和252.90 mg/L(轉(zhuǎn)換成樣品干重的質(zhì)量濃度分別為5.52 mg/mL和11.14 mg/mL)；從平行提取和分步提取的結(jié)果看，石油醚提取物對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑菌效果均較好。

比較表3和表5，從EC9。結(jié)果可以看出：細(xì)辛不同溶劑提取物和精油對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制效果強(qiáng)于對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。如在分步提取中，石油醚和乙醇提取物及精油對(duì)孢子萌發(fā)的EC₅₀分別為344.21 mg/L、2 266.70 mg/L和252.90 mg/L，而對(duì)菌絲生長(zhǎng)的EC₅₀分別為347.06 mg/L、35 504 mg/L和318.28 mg/L。

3 結(jié)論與討論

從中藥植物中篩選植物源殺菌劑有廣闊的研究前景。本試驗(yàn)采用平行提取法和分步提取法對(duì)遼細(xì)辛根的不同溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)粗提取物和精油對(duì)灰葡萄孢菌的生物活性進(jìn)行了研究，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了供試樣品對(duì)菌絲生長(zhǎng)的作用，采用孢子萌發(fā)法測(cè)定了供試樣品對(duì)孢子萌發(fā)的作用。結(jié)果表明，細(xì)辛根不同溶劑提取物和精油對(duì)灰葡萄孢菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，其中，精油和石油醚提取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑菌效果較好，EC₅₀。分別為159.98 mg/L和177.44 mg/L，乙醇和氯仿提取物的抑菌效果較差，ECs。達(dá)341.49 mg/L和313.62 mg/L；精油對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果最好，ECs。僅為125.29 mg/L，其次為石油醚提取物，EC₅₀為173.23 mg/L，抑菌效果最差的為乙醇提取物，EC₅₀為390.35 mg/L。

對(duì)于同一種提取物來說，在供試條件下，細(xì)辛各提取物抑菌效果均隨濃度的加大而增高，且對(duì)其孢子萌發(fā)的抑制效果好于對(duì)其菌絲生長(zhǎng)的抑制效果，如精油對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的EC₉₀為252.9 mg/L；而對(duì)其菌絲生長(zhǎng)的EC₉₀為318.28 mg/L。

對(duì)于同一種病原菌來說，在同一供試濃度下，細(xì)辛不同溶劑提取物的抑菌效果不同，總體來看，石油醚提取物的抑菌效果最好，而乙醇提取物的抑菌效果最差，說明細(xì)辛所含的主要抑菌活性成分易被極性小的有機(jī)溶劑所提取。精油的抑菌效果與石油醚提取物的抑菌效果相當(dāng)，說明細(xì)辛精油中含有抑菌活性物質(zhì)。

王樹桐等的研究結(jié)果表明：細(xì)辛的乙醇提取物對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)，分生孢子萌發(fā)的抑制作用均與濃度呈正相關(guān)；細(xì)辛提取物稀釋100～600倍均對(duì)番茄灰霉病菌分生孢子的產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的抑制作用。本試驗(yàn)的研究結(jié)果與之相吻合。另外張國(guó)珍等的研究結(jié)果表明麻黃和細(xì)辛的揮發(fā)油對(duì)Alternaria panax等5種真菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均表現(xiàn)了一定的抑制作用，只是對(duì)于不同的真菌抑制生長(zhǎng)的濃度有較大差別，而且2種揮發(fā)油還不同程度的表現(xiàn)出了一定的熏蒸作用，對(duì)Rhizoctoniasolani的IC₅₀分別為53.7 mg/L和87.8 mg/L，其熏蒸作用均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)。李永剛等測(cè)試了30種中藥的抑菌活性，并認(rèn)為10％的細(xì)辛水提取物對(duì)立枯絲核菌等有一定的抑菌效果。上述研究表明，細(xì)辛作為植物源殺菌劑，具有廣闊的開發(fā)利用價(jià)值。