劉　召　雷仲仁　花保禎　王　音　問(wèn)錦曾　黃　虹

摘要病癥觀察表明，煙粉虱感染白僵菌96h后蟲(chóng)體顏色變?yōu)樯罴t色。組織切片觀察表明，白僵菌處理后36 h，可在表皮下面觀察到芽生孢子。48 h后可在體內(nèi)觀察到明顯的菌絲段。60 h可以觀察到菌絲入侵到脂肪體中，96 h發(fā)現(xiàn)內(nèi)部組織器官病變，肌肉邊界變得模糊不清，體內(nèi)出現(xiàn)大量菌絲，120 h后菌絲突破體壁向外生長(zhǎng)，132 h后形成菌絲層。

關(guān)鍵詞煙粉虱；白僵菌；致病性；組織病理變化

中圖分類號(hào)S 476．12

煙粉虱(Bemisia tabaci)屬同翅目粉虱科，小盼虱屬，是源于亞熱帶地區(qū)的一種刺吸性害蟲(chóng)。在我國(guó)最早記錄于1949年，但是并沒(méi)有大規(guī)模危害成災(zāi)的報(bào)道。隨著新的生物型——B型煙粉虱的入侵和傳播，煙粉虱在我國(guó)許多地方大規(guī)模暴發(fā)并造成了嚴(yán)重危害，尤其對(duì)甘藍(lán)、青花菜、番茄、甜瓜、黃瓜等瓜果蔬菜和一些園林花卉作物如一品紅、菩提樹(shù)等危害最重。其危害方式主要是直接刺吸植物汁液，傳播植物病毒、分泌蜜露影響植物光合作用引發(fā)其他病害。

傳統(tǒng)的防治方式主要是化學(xué)防治，但是隨著殺蟲(chóng)劑大規(guī)模頻繁使用，煙粉虱對(duì)農(nóng)藥的抗性不斷增加，既增加了防治成本，又污染環(huán)境，影響人們的身體健康，于是尋找可替代的生物殺蟲(chóng)劑已經(jīng)刻不容緩。蟲(chóng)生真菌是生物防治的一個(gè)重要組成部分，因其容易繁殖，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)溫血?jiǎng)游锇踩葍?yōu)點(diǎn)引起了人們的極大興趣。關(guān)于白僵菌對(duì)煙粉虱的防治，Wraigh等已經(jīng)進(jìn)行了初步篩選研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)煙粉虱有較好的致病性，LC₅₀。在50—150個(gè)／mm₅₀。Vicentini也進(jìn)行了相應(yīng)的研究。在美國(guó)、墨西哥和中美的一些國(guó)家，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出白僵菌的可濕性粉劑和懸浮劑進(jìn)行粉虱等害蟲(chóng)的防治。但是關(guān)于白僵菌感染煙粉虱后，蟲(chóng)體組織病理變化，一直未見(jiàn)有人報(bào)道，本文從本實(shí)驗(yàn)室收藏的白僵菌中篩選了一種毒力較高的菌株一加拿大1號(hào)，進(jìn)行了其感染煙粉虱后的組織病理變化研究，為白僵菌對(duì)煙粉虱的致病機(jī)理研究提供一些依據(jù)。

1材料與方法

1．1供試菌株

菌株加拿大1號(hào)為加拿大同行贈(zèng)送。用薩氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得分生孢子粉，用無(wú)菌0．1％吐溫一80溶液配制成孢子懸浮液用于接種。

1．2供試蟲(chóng)源

挑選4～5片葉的嫩甘藍(lán)苗，置于溫室內(nèi)用甘藍(lán)飼養(yǎng)的煙粉虱種群中，24 h后驅(qū)逐掉所有成蟲(chóng)后取出放人(25i1)℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，10 d后選取帶有約15頭／cm₂3齡煙粉虱幼蟲(chóng)的葉片待用。

1．3試蟲(chóng)處理

挑選約2 cm2的干凈甘藍(lán)葉片，以保證供試蟲(chóng)數(shù)目約30頭。在孢子含量為1．2X10₇個(gè)／mL。的白僵菌懸浮液中浸泡30s后，置于吸水紙上自然風(fēng)干后，放人盛有凝固的瓊脂：水＝1：100的培養(yǎng)皿中。此后，每隔12 h取約10頭煙粉虱幼蟲(chóng)待用。

1．4組織切片的制備

參照王音、黃東如等方法做適當(dāng)?shù)淖儎?dòng)。樣品在包氏(Bouins)固定液(飽和苦味酸水溶液75mL，40％甲醛25mL，冰醋酸25mL)中固定24h后，分別在50％和70％的乙醇溶液中沖洗數(shù)次至蟲(chóng)體組織中的黃色完全褪去，然后保存于70％的乙醇中。經(jīng)70％～100％的梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，厚度為8 pm，在Olympus顯微鏡下觀察照相。

1．5煙粉虱感染后外部癥狀觀察

分別以孢子含量1．2X10₇、1．2X10₆、1．2X10₅個(gè)／mL接種煙粉虱3齡幼蟲(chóng)各30頭。以后每天觀察煙粉虱幼蟲(chóng)存活情況以及感染真菌后蟲(chóng)體外部特征并將蟲(chóng)尸保濕培養(yǎng)，直至蟲(chóng)體長(zhǎng)出白色菌絲，將菌絲挑至載玻片上進(jìn)行鏡檢確定其是否為白僵菌感染。

2結(jié)果與分析

2．1煙粉虱感染白僵菌后的外部癥狀觀察

煙粉虱感染白僵菌后，在前3天內(nèi)，蟲(chóng)體顏色、形狀并無(wú)明顯變化。第4天可以觀察到感染的煙粉虱蟲(chóng)體變?yōu)榭捎萌庋壑苯优c健康蟲(chóng)體區(qū)分的紅褐色，與Wraight等觀察結(jié)果相吻合，但形狀仍為扁橢圓狀，無(wú)明顯變化。在濕度較低的條件下，蟲(chóng)體慢慢變?yōu)楦稍锏谋馄綘睿瑴\黃色。若將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上保濕，兩天后可見(jiàn)到白色菌絲長(zhǎng)出。一般為腹部?jī)蓚?cè)最先長(zhǎng)出菌絲，而頭部和尾部菌絲較少。若繼續(xù)培養(yǎng)可得到白僵菌的分生孢子。

2．2白僵菌入侵煙粉虱若蟲(chóng)過(guò)程及組織病理變化

白僵菌接種到3齡煙粉虱幼蟲(chóng)體表10h后就能萌發(fā)(另文發(fā)表)。36 h后，真菌即能人侵到蟲(chóng)體內(nèi)，并在表皮下產(chǎn)生芽生孢子，體壁與內(nèi)部組織間出現(xiàn)間隙，同時(shí)內(nèi)部組織附近也開(kāi)始出現(xiàn)芽生孢子(圖1a)。在48 h時(shí)，表皮下的芽生孢子生長(zhǎng)為菌絲段并向體內(nèi)各個(gè)組織器官入侵(圖1b)。96 h時(shí)蟲(chóng)體顏色發(fā)生明顯的變化，菌絲在體內(nèi)大量增加(圖1c)，肌肉等組織器官的邊界已經(jīng)變得模糊不清，脂肪體內(nèi)出現(xiàn)菌絲段(圖1d)，表皮下出現(xiàn)向外生長(zhǎng)的菌絲(圖1e)。在120 h時(shí)菌絲就能成功的突破表皮向外生長(zhǎng)(圖1f)，隨著量的增大，可能進(jìn)行再次侵染。

通過(guò)接菌不同時(shí)間的組織切片觀察表明：若蟲(chóng)體表附著孢子萌發(fā)后產(chǎn)生定向生長(zhǎng)的芽管，然后入侵到表皮內(nèi)部，在表皮下面產(chǎn)生芽生孢子。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，芽生孢子量增多，芽生孢子萌發(fā)為菌絲。菌絲對(duì)寄主組織的侵染通常沒(méi)有選擇性，部分菌絲可以沿表皮生長(zhǎng)，而進(jìn)入血腔的菌絲通常就在血腔中繁殖，然后逐步入侵到各個(gè)組織器官中，受到侵染的組織逐步發(fā)生病變，使昆蟲(chóng)解體死亡。

3討論

孢子附著到昆蟲(chóng)體表后，孢子的萌發(fā)率以及芽管的生長(zhǎng)速率在一定程度上決定著真菌入侵成功與否。James研究表明，煙粉虱表皮內(nèi)的脂類物質(zhì)對(duì)白僵菌的萌發(fā)有一定的抑制作用。作者觀察到孢子接種后10h就在體表附著并且萌發(fā)，芽管向表皮定向生長(zhǎng)，表明白僵菌此時(shí)已經(jīng)打破了表皮脂類物質(zhì)對(duì)白僵菌萌發(fā)的抑制作用，成功地附著于體表；并且24h后就能觀察到表皮下面產(chǎn)生芽生孢子，說(shuō)明白僵菌已經(jīng)成功地突破表皮入侵。而有的白僵菌株系對(duì)煙粉虱的毒力非常低，甚至沒(méi)有致病性，在接種后沒(méi)有看到孢子在蟲(chóng)體上萌發(fā)，可能與表皮的脂類物質(zhì)對(duì)白僵菌孢子萌發(fā)的抑制作用，或者與白僵菌孢子的附著能力及萌發(fā)率有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)白僵菌侵染煙粉虱的主要途徑是表皮侵染，發(fā)生體色改變是由于在侵染過(guò)程中真菌產(chǎn)生了卵孢素，但是卵孢素的功能及其作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。組織病理變化的觀察表明，發(fā)生體色改變時(shí)，菌絲在蟲(chóng)體內(nèi)部已經(jīng)大量繁殖，蟲(chóng)體大部分組織(肌肉、脂肪體)已經(jīng)發(fā)生病變，說(shuō)明蟲(chóng)體已經(jīng)開(kāi)始解離死亡。