徐宜宏　紀(jì)明山　楊春喜　張　弘　于敬沂　

摘要從自然死亡的玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)分離獲得一株對(duì)玉米螟高毒的蘇云金芽孢桿菌，編號(hào)為HB-3。該菌株產(chǎn)生菱形和方形兩種晶體蛋白。純化晶體及孢晶混合物的毒力測(cè)定結(jié)果表明，該菌株對(duì)玉米螟具有較高毒力，LC5。分別為5．82μg／mL和5．94μg／mL，對(duì)尖音庫(kù)蚊也有一定毒力，LC₅₀分別為16．59μg／mL和17．50／μg／mL。生理生化特性研究結(jié)果表明，HB-3與已知的蠟螟亞種(Bacillusthuringiensis subsp．galleriae)基本一致，血清型為H5ab。晶體蛋白的SDS-PAGE分析表明，HB-3菌株晶體蛋白至少由分子量為133kDa、65 kDa、45 kDa和23 kDa的4種多肽組成。

關(guān)鍵詞蘇云金芽孢桿菌；晶體蛋白；毒力測(cè)定；生物學(xué)

中圖分類號(hào)S 476．11

蘇云金芽孢桿菌(acillusthuringiensis，Bt)是一種革蘭氏陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)菌，桿狀，能形成內(nèi)生芽孢。該菌在自然界普遍存在，資源豐富，不同地理生態(tài)環(huán)境中其群體的分布特點(diǎn)、基因類型、殺蟲(chóng)譜等具有多樣性。中國(guó)地域遼闊，地理、生態(tài)與氣候條件復(fù)雜，具有豐富的生物多樣性。作者從東北地區(qū)自然生態(tài)環(huán)境中死亡玉米螟幼蟲(chóng)蟲(chóng)體分離出一株殺玉米螟幼蟲(chóng)和尖音庫(kù)蚊幼蟲(chóng)的高毒力菌株，并對(duì)其形態(tài)、晶體蛋白、血清型分類及殺蟲(chóng)毒力等生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，研究結(jié)果如下。

1材料與方法

1．1供試菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株有蘇云金亞種(H₁)、幕蟲(chóng)亞種(HH₁)以色列亞種(HH₁₄)、HD-l(HH_3ab)、阿萊亞種(HH_3ac)、鲇澤亞種(HH₇)、庫(kù)斯塔克亞種(HH_3abc)、猝倒亞種(HH_4ab)、蠟螟亞種(HH_5ab)。用于生理生化特性及H—血清型鑒定，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。蘇云金芽孢桿菌HB-3為本實(shí)驗(yàn)室從自然死亡玉米螟幼蟲(chóng)分離獲得。

1．2供試?yán)ハx(chóng)

玉米螟(Ostrinia．furnacalis Guenee)初齡幼蟲(chóng)、尖音庫(kù)蚊(Culexpipiem Linnaeus)3齡幼蟲(chóng)，均為沈陽(yáng)化工研究院農(nóng)藥生物測(cè)定中心的室內(nèi)飼養(yǎng)敏感品系。

1．3培養(yǎng)基和試劑

LB固體培養(yǎng)基：酵母浸膏0．5％、蛋白胨1．0％、瓊脂1．8％、NaCll．0％，pH7．0。LB液體培養(yǎng)基：酵母浸膏0．5％，蛋白胨1．0％，NaCl 1．0％，pH7．0。LB半固體培養(yǎng)基：酵母浸膏0．25％，蛋白胨0．5％，NaCl 0．5％，瓊脂0．2％一0．3％，pH7．0。晶體蛋白裂解液：10g／LSDS，2％p—巰基乙醇(體積分?jǐn)?shù))，6mol／L尿素，pH 10．0。

1．4培養(yǎng)與觀察

將冰箱保存的斜面菌種活化后接種到LB固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)18—24h，觀察菌落生長(zhǎng)情況；取25 mLLB液體培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中并接種，置30℃恒溫?fù)u床，230r／min振蕩培養(yǎng)8 h后涂片鏡檢。觀察菌體的運(yùn)動(dòng)性及鞭毛情況。

1．5伴胞晶體的分離純化及晶體蛋白濃度的測(cè)定

參照王瑛等的液體雙相法，進(jìn)行伴孢晶體的分離和純化。發(fā)酵液中晶體蛋白濃度測(cè)定參照顧真榮，彭中允方法，將提純的晶體配成2．0 mg／mL濃度的母液，稀釋成一定梯度濃度后，經(jīng)過(guò)離心處理，制成標(biāo)準(zhǔn)晶體液，用紫外吸收法測(cè)定ODH₂₈₀。值，繪制晶體量與光密度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將發(fā)酵液制備成樣品晶孢液后按照標(biāo)準(zhǔn)晶體液的處理方法處理后，用紫外吸收法測(cè)定ODH₂₈₀值。

1．6生物測(cè)定

將純化晶體和孢晶混合物制成不同濃度的感染液，測(cè)定對(duì)玉米螟和尖音庫(kù)蚊的室內(nèi)毒力。其中玉米螟的生物測(cè)定采用感染飼料法，每組供試幼蟲(chóng)30頭，每個(gè)處理3次重復(fù)。于25℃飼養(yǎng)48h，調(diào)查死亡頭數(shù)，計(jì)算LC₂₈₀。尖音庫(kù)蚊的生物測(cè)定參照陳在餌等的方法進(jìn)行，每組供試幼蟲(chóng)30頭，每個(gè)處理3次重復(fù)。于25℃飼養(yǎng)48h，調(diào)查死亡數(shù)量，計(jì)算LC₅₀。

1．7生理生化試驗(yàn)及H-血清型鑒定

按高秀梨方法進(jìn)行。

1．8晶體蛋白SDS-PAGE電泳分析

SDS-PAGE凝膠制備參照F．奧斯伯的方法，濃縮膠和分離膠濃度分別為4％和10％。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白組成為：116 kDa、66kDa、45kDa、25kDa和14kDa。在晶體樣品中加人等量的樣品緩沖液混勻，沸水煮3～5 min。10 000 r／min離心2 min，取上清液上樣。采用恒壓電泳，濃縮膠中電壓為100V；分離膠中電壓為150V。染色，脫色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白計(jì)算分子量。

2結(jié)果

2．1形態(tài)與培養(yǎng)特征

HB-3菌株革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞桿狀，兩端鈍圓，單生、雙聯(lián)體或以雙聯(lián)體為單位連成短鏈狀，菌體大小(1．08～1．30)μmX(2．5～3．18)μm，芽孢橢圓形，孢囊微膨大，有的近中生，有的居于菌體一端(較少)，大小為(0．73—1．10)btmX(1．40～1．95)pm，晶體有菱形和方形兩種(圖1)，菱形晶體的大小為(0．72～0．85)pmX(1．02～1．36)μm，方形晶體大小為(1．07～1．19)μmX(1．06一1．23)μm，周生鞭毛，運(yùn)動(dòng)活躍。在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落為圓形，白色，邊緣不光滑，不透明。

2．2晶體蛋白濃度

在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定樣品280 nm下的吸光值為0．748，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其晶體蛋白濃度可達(dá)5．84mg／mL。

2．3毒力測(cè)定結(jié)果

通過(guò)生物測(cè)定方法考察了HB-3菌株的純化晶體和孢晶混合物對(duì)玉米螟、尖音庫(kù)蚊的毒力。該菌株對(duì)玉米螟有較高的毒力，純化晶體和孢晶混合物的LC₅₀。值分別為5．82μg／mL。和5．94μg／mL。對(duì)尖音庫(kù)蚊有一定的毒力。純化晶體和孢晶混合物的LC₅₀值分別為16．59μg／mL。和17．50μg／mL。(表1)。

2．4生理生化試驗(yàn)及H—血清型鑒定結(jié)果

按照常規(guī)方法對(duì)菌株的10項(xiàng)生理生化性狀進(jìn)行了研究，供試全部標(biāo)準(zhǔn)菌株基本都可重復(fù)原始性狀。結(jié)果見(jiàn)表2(附后)。

從表2中可以看出，HB-3菌株在其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、尿酶，不產(chǎn)生卵磷脂酶，可

以利用七葉靈、甘露糖、蔗糖、水楊苷、葡萄糖，并可生成色素。各項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較，不難看出HB-3菌株與蠟螟亞種(Haab)的生化反應(yīng)結(jié)果最為接近，僅菌膜的結(jié)果不一致。而與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株相比則有較大差異。因此，初步斷定該菌株屬于蠟螟亞種。

采用標(biāo)準(zhǔn)菌株H₁—H₁₄與HB-3進(jìn)行了交叉凝集試驗(yàn)和交叉吸收試驗(yàn)(表3)。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)菌株H₁—H₁₄與HB-3的交叉凝集試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HB-3只與蠟螟亞種(Haab)發(fā)生凝聚反應(yīng)。從而初步斷定HB-3菌株與蠟螟亞種(H_5ab具有相同的鞭毛抗原因子。從表3可以看出，HB-3與蠟螟亞種(H_5ab)發(fā)生凝集反應(yīng)的凝集效價(jià)為20 480。從交叉凝集吸收試驗(yàn)結(jié)果(表3)中可以看出標(biāo)準(zhǔn)抗血清H_5ab被HB-3菌株的鞭毛抗原飽和后，不再與標(biāo)準(zhǔn)菌株的鞭毛抗原發(fā)生凝集反應(yīng)；同樣當(dāng)HB-3菌株的抗血清被相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株的鞭毛抗原飽和后，也不再與其本身的鞭毛抗原起反應(yīng)。說(shuō)明HB-3菌株與其相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株蠟螟亞種(H_5ab)具有完全相同的鞭毛抗原因子。因此，可以確定菌株HB-3屬蘇云金芽孢桿菌血清型H_5AB。

2．5晶體蛋白SDS—PAGE分析結(jié)果

通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶比較，可知HB-3菌株晶體蛋白主要由4種多肽組成，其分子量分別為133kDa、65 kDa、45 kDa和23 kDa(圖2)。根據(jù)查閱資料”1，產(chǎn)生菱形和方形晶體的Bt菌株，其晶體蛋白成分主要為130～140 kDa、70～80 kDa，因此認(rèn)為133 kDa、65 kDa為該晶體蛋白的活性成分。

3討論

本研究從自然死亡的玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)分離到的HB-3菌株不僅對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有較高毒力，同時(shí)還對(duì)尖音庫(kù)蚊幼蟲(chóng)也表現(xiàn)出一定的毒力，表明從自然界中的死亡蟲(chóng)體中分離蘇云金芽孢桿菌是一種行之有效的方法，同時(shí)也說(shuō)明從蟲(chóng)尸內(nèi)篩選高毒力菌株并不一定要從目標(biāo)昆蟲(chóng)體內(nèi)分離。

關(guān)于晶體蛋白的提純方法普遍采用的主要有3種：液體雙相法、不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法和堿裂解法。采用液體雙相分離法可以獲得理想純度的晶體，但影響該法提純純度的因素較多；應(yīng)用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法提取晶體蛋白量較少且最適的蔗糖濃度梯度不易控制，孢晶混合物不能完全分離，而且離心時(shí)間長(zhǎng)；堿裂解法操作簡(jiǎn)便，時(shí)間短，蛋白提取量大，但蛋白純度較低，不適合晶體蛋白特性的研究，比較適合大量提取。

本試驗(yàn)中認(rèn)為133kDa、65kDa為該晶體蛋白的活性成分，主要根據(jù)喻子牛的《蘇云金芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用》一書(shū)中關(guān)于Bt伴胞晶體的毒力機(jī)理部分的相關(guān)說(shuō)明。書(shū)中認(rèn)為一般分子量為27kDa左右的多肽主要存在于不規(guī)則形伴胞晶體中，而該類晶體一般對(duì)鱗翅目無(wú)毒，對(duì)鞘翅目有高毒力，而根據(jù)本試驗(yàn)觀察的晶體形態(tài)和毒力測(cè)定結(jié)果，初步認(rèn)為譜帶中的23kDa的蛋白并不是該菌的活性成分。45kDa的蛋白多肽未見(jiàn)報(bào)道，因此認(rèn)為分子量為45kDa和23kDa的蛋白可能是由于大分子量的蛋白降解引起的。

毒力測(cè)定結(jié)果表明，該菌株表明純化晶體的LC₅₀略高于孢晶混合物，說(shuō)明該菌株的活性成分主要為晶體蛋白，芽孢低毒或無(wú)毒。這與很多已發(fā)表的研究成果有所不同，可能與菌株間存在的差異有關(guān)。