林鋟武 陳以國

(上海醫(yī)科大學(xué)華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,上海200040;1遼寧中醫(yī)學(xué)院針灸系)

摘 要 運(yùn)用CB睭RP神經(jīng)示蹤法對內(nèi)關(guān)、公孫配伍機(jī)理從神經(jīng)解剖學(xué)角度進(jìn)行探討。結(jié)果:內(nèi)關(guān)、公孫配伍運(yùn)用,其針刺信息可在脊髓內(nèi)經(jīng)中間內(nèi)、外側(cè)核的神經(jīng)元纖維感傳至相應(yīng)脊髓節(jié)段,再分別通過與交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)形成突觸聯(lián)系,形成在脊髓層次的協(xié)同增效關(guān)系;同時通過兩穴在脊髓內(nèi)相應(yīng)神經(jīng)元向孤束核的投射纖維產(chǎn)生突觸聯(lián)系,實現(xiàn)對胃等內(nèi)臟傳入信息在脊髓和孤束核水平的調(diào)節(jié)整合作用。

主題詞 穴,內(nèi)關(guān)/解剖組織學(xué) 穴,公孫/解剖組織學(xué) 神經(jīng)解剖學(xué)內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)穴,公孫為足太陰脾經(jīng)穴,此上下兩肢、經(jīng)脈不同、距離很遠(yuǎn)的兩穴,在針灸臨床上卻常一起配伍運(yùn)用,自古以來作為"八脈交會穴"的用穴之一,其機(jī)理何在?中醫(yī)認(rèn)為此兩穴是通過心包經(jīng)、脾經(jīng)、陰維脈及沖脈交匯于胃、心、胸部位,來實現(xiàn)其治療作用上的協(xié)同增效關(guān)系。歷來對于內(nèi)關(guān)、公孫的研究,多為中醫(yī)傳統(tǒng)理論探討、臨床應(yīng)用觀察及單穴實驗研究,而對于兩穴配伍相關(guān)性的研究,一直缺乏實驗佐證。除了其它假說,目前大多認(rèn)為經(jīng)絡(luò)腧穴實質(zhì)與神經(jīng)體液關(guān)系較大。所以,設(shè)想內(nèi)關(guān)、公孫配伍能有效地治療胃等內(nèi)臟疾病,是否與兩穴的神經(jīng)纖維投射在中樞神經(jīng)內(nèi)的延伸與聯(lián)系有關(guān)?兩穴區(qū)的神經(jīng)節(jié)段支配關(guān)系可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有著一定的聯(lián)系。本文應(yīng)用霍亂毒素B亞單位(choleratoxinsubunitB)耦聯(lián)辣根過氧化物酶(CB睭RP)法對大鼠"內(nèi)關(guān)"、"公孫"單穴及兩穴配伍后,在相應(yīng)運(yùn)動神經(jīng)元的分布和樹突構(gòu)筑進(jìn)行研究,以期對配穴的理論與臨床實踐提供一些神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)。1 材料和方法本實驗用中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)合成的霍亂毒素B亞單位耦聯(lián)辣根過氧化物酶(CB睭RP)作為神經(jīng)解剖學(xué)探針;實驗動物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所動物繁育場提供的Wistar成年雌性健康大鼠,體重在200～250g之間,每組8只,并根據(jù)比較解剖學(xué)方法,選取大鼠"內(nèi)關(guān)"、"公孫"穴位。

1.1 實驗分組第1組:"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)注射CB睭RP;第2組:"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)注射CB睭RP后電針同側(cè)"公孫";第3組:"公孫"穴區(qū)注射CB睭RP;第4組:"公孫"穴區(qū)注射CB睭RP后電針同側(cè)"內(nèi)關(guān)";第5組:胃壁注射CB睭RP;第6組:胃壁注射CB睭RP后電針右側(cè)"內(nèi)關(guān)"、"公孫"。

1.2 實驗方法(1)第1組與第2組:先將0.3%CB睭RP5μl用微量注射器注射至右側(cè)"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)(注射CB睭RP前先將動物麻醉),第2組待動物清醒后配伍電針右側(cè)"公孫"穴,使用ZYZ1型多功能針灸儀,頻率為2～100c/s,疏密波,強(qiáng)度調(diào)在低檔2～4之間,以動物能耐受為限,每次電針20min,每日1次,存活72h后灌注固定,取同側(cè)脊髓C3～S2節(jié)段。第3組與第4組:將0.3%CB睭RP5μl用微量注射器注射至右側(cè)"公孫"穴區(qū),第4組待動物清醒后配伍電針右側(cè)"內(nèi)關(guān)"穴20min,每日1次,存活84h后灌注固定,取同側(cè)脊髓C3～S3節(jié)段。第5組與第6組:將0.3%CB睭RP10μl用微玻管套接微量注射器多點注射于胃的前壁、后壁、幽門和賁門的漿膜下與肌層之間,第6組待動物清醒后再行電針右側(cè)"內(nèi)關(guān)"、"公孫"穴20min,每日1次,存活48h后灌注固定,取延髓、腹腔神經(jīng)節(jié)和C4～L3節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)。(2)固定、取材及CB睭RP酶組化過程[1]:①固定標(biāo)本:麻醉動物(戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射)后,將灌注針經(jīng)由左心室插入至主動脈并固定,剪開右心耳。按順序灌注下列液體(須將氣泡排盡):a.21℃生理鹽水150ml速灌,灌注壓為100cmH2O。b.4℃的固定液500ml,先快速灌注1/3后,再慢速灌注,總灌注時間為60min。②取材及切片:小心剝離需要的神經(jīng)組織(延髓、脊髓、背根神經(jīng)節(jié)、腹腔神經(jīng)節(jié)),投入30%的蔗糖PB緩沖液過夜。以冠狀或水平切面冰凍切片,片厚40μm,接片于0.1MPB緩沖液中。③CB睭RP酶組化過程:將切片以雙蒸水洗6遍后,以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)法[2]顯色,光學(xué)顯微鏡明、暗視野觀察,觀察后在暗視野下照相。

2 實驗結(jié)果第1組:脊髓前角中CB睭RP標(biāo)記細(xì)胞的節(jié)段性分布,在C6～8節(jié)段Rexed分層屬于第Ⅸ層中發(fā)現(xiàn)陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元和神經(jīng)終末纖維。每張切片可見1～5個陽性標(biāo)記細(xì)胞,其樹突野可達(dá)第Ⅶ層。

第2組:脊髓背角中CB睭RP標(biāo)記細(xì)胞的節(jié)段性分布及其特點,a.經(jīng)配伍電針同側(cè)"公孫"穴后,"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元分布節(jié)段擴(kuò)大,可在C4～8節(jié)段的第Ⅸ層中出現(xiàn);其樹突野擴(kuò)大,向第Ⅶ、Ⅵ、Ⅴ層延伸,其中C8節(jié)段樹突達(dá)第Ⅶ層,并向其中間內(nèi)側(cè)核、中間外側(cè)核特異性延伸。b.在縱切面切片中見到其樹突野向縱向、橫向延伸和聯(lián)系明顯加強(qiáng),并可在陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元周圍見到大量神經(jīng)終末標(biāo)記(見圖1,圖2)。

圖1 顯示"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)配伍電針后在C6節(jié)段陽性標(biāo)記Mn之樹突野延伸至第Ⅶ、Ⅵ、Ⅴ層 10×6.3

圖2 顯示"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)配伍電針后在縱切面切片中可見陽性標(biāo)記Mn顯著增多及其樹突野明顯地向縱向橫向聯(lián)系和可見周圍的神經(jīng)終末標(biāo)記 16×6.3

第3組:脊髓前角中CB睭RP標(biāo)記細(xì)胞的節(jié)段分布,在L4～6節(jié)段第Ⅸ層中出現(xiàn)陽性標(biāo)記的運(yùn)動神經(jīng)元和神經(jīng)終末纖維。每張切片可見1～7個陽性標(biāo)記細(xì)胞,其樹突野可達(dá)第Ⅶ層。

第4組:脊髓前角中CB睭RP標(biāo)記細(xì)胞節(jié)段性分布及其特點,a.經(jīng)配伍電針同側(cè)"內(nèi)關(guān)"穴后,"公孫"穴區(qū)陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元節(jié)段分布擴(kuò)大至L4～S3節(jié)段,于其第Ⅸ層出現(xiàn)陽性標(biāo)記細(xì)胞和神經(jīng)終末纖維,其樹突向第Ⅶ、Ⅵ、Ⅴ層特異性延伸。b.在中間內(nèi)側(cè)核、中間外側(cè)核出現(xiàn)陽性神經(jīng)纖維和終末標(biāo)記。c.縱切面中可見到陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元增多和樹突野明顯地向縱向、橫向延伸及相互聯(lián)系。d.S2,3節(jié)段陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元樹突特異性延伸至中間外側(cè)核(骶副交感核,見圖3～圖5)。

第5組:a.在孤束核內(nèi)發(fā)現(xiàn)陽性標(biāo)記細(xì)胞及大量神經(jīng)終末纖維,為多角型細(xì)胞,兩側(cè)基本對稱。b.腹腔神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)陽性標(biāo)記神經(jīng)元,以大、中型為主,呈梭型、多角型,散在分布;可見到陽性標(biāo)記神經(jīng)纖維。c.在C4～L3節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)中可出現(xiàn)陽性標(biāo)記細(xì)胞,以T5～T9節(jié)段最多。第6組:a.相同的存活期內(nèi),配伍電針后在孤束核的陽性標(biāo)記細(xì)胞和神經(jīng)終末纖維均不及第5組,其陽性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01,見表1)。b.配伍電針后,腹腔神經(jīng)節(jié)內(nèi)陽性標(biāo)記細(xì)胞明顯少于單純注射CB睭RP組(P<0.05,見表1),并可見陽性標(biāo)記神經(jīng)纖維減少。c.配伍電針后,僅在4只大鼠T8,T9節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)少許陽性標(biāo)記細(xì)胞。

圖3 顯示"公孫"穴區(qū)配伍電針后在L6節(jié)段陽性標(biāo)記Mn樹突野延伸至第Ⅶ、Ⅵ、Ⅴ層 10×6.3

圖4 顯示"公孫"穴區(qū)配伍電針后在縱切面切片中可見陽性標(biāo)記Mn顯著增多及其樹突野明顯地向縱向橫向聯(lián)系和可見周圍的神經(jīng)終末標(biāo)記 16×6.3

圖5 "公孫"穴區(qū)配伍電針后在S2,S3節(jié)段陽性標(biāo)記Mn樹突特異性延伸至中間外側(cè)核(骶副交感核) 10×6.3

討論

3.1 內(nèi)關(guān)與交感神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)解剖學(xué)聯(lián)系本實驗采用對比的方法設(shè)立"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)注射CB睭RP組和"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)注射CB睭RP后配合電針"公孫"穴組。結(jié)果,第1組與第2組"內(nèi)關(guān)"注射CB睭RP都能在脊髓C6～C8節(jié)段發(fā)現(xiàn)陽性運(yùn)動細(xì)胞,但第2組配伍電針"公孫"穴后,不但脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元陽性標(biāo)記細(xì)胞的節(jié)段性分布擴(kuò)大,運(yùn)動神經(jīng)元陽性標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)在第Ⅸ層,而且,其樹突野特異性延伸至與內(nèi)臟活動有關(guān)的第Ⅶ(中間外側(cè)核、中間內(nèi)側(cè)核)、Ⅵ、Ⅴ層。此結(jié)果提示針刺可增加CB睭RP陽性細(xì)胞標(biāo)記作用,不但存在于相同的神經(jīng)節(jié)段,也存在著跨節(jié)段的增強(qiáng)效應(yīng)。配伍"公孫"電針后能明顯加強(qiáng)"內(nèi)關(guān)"穴區(qū)運(yùn)動神經(jīng)元與交感神經(jīng)系統(tǒng)的聯(lián)系,這一效應(yīng)可能是通過中間內(nèi)、外側(cè)核內(nèi)神經(jīng)元間的相互影響來實現(xiàn)的。

3.2 公孫與副交感神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)解剖學(xué)聯(lián)系本實驗首次應(yīng)用CB睭RP對大鼠"公孫"穴區(qū)進(jìn)行神經(jīng)解剖學(xué)角度的探討,結(jié)果當(dāng)配伍電針"內(nèi)關(guān)"穴時,"公孫"穴區(qū)逆行陽性標(biāo)記細(xì)胞的節(jié)段性分布擴(kuò)大,其中陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元的樹突野向第Ⅶ、Ⅵ、Ⅴ層特異性延伸,在中間內(nèi)側(cè)核出現(xiàn)神經(jīng)纖維,特別是S2,S3節(jié)段陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元樹突特異性延伸至中間外側(cè)核(骶副交感核),提示配伍電針"內(nèi)關(guān)"后,對"公孫"穴區(qū)相應(yīng)的運(yùn)動神經(jīng)元與副交感神經(jīng)系統(tǒng)之間的聯(lián)系有正向調(diào)節(jié)作用。

3.3 關(guān)于第Ⅸ層陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元周圍的神經(jīng)終末纖維本實驗發(fā)現(xiàn)第Ⅸ層陽性標(biāo)記細(xì)胞周圍出現(xiàn)神經(jīng)終末纖維,這與Sterling和Kuypers在貓下位頸節(jié)的后根纖維終入全部9層中,其中有相當(dāng)數(shù)量的后根纖維終止于運(yùn)動神經(jīng)元的實驗結(jié)果相同[3,4]。因此我們可以進(jìn)一步推測,當(dāng)針刺內(nèi)關(guān)、公孫穴時,針感可能經(jīng)由傳入纖維到達(dá)第Ⅸ層而與前角中的運(yùn)動神經(jīng)元形成單突觸或多突觸聯(lián)系,促使運(yùn)動神經(jīng)元樹突特異性地延伸,而與相應(yīng)的神經(jīng)元纖維產(chǎn)生聯(lián)系,其中一部分纖維將沖動向上傳導(dǎo),形成受針對象(大腦皮層)的得氣感,一部分纖維將沖動向下傳導(dǎo)形成施針者針下的得氣感[5],另有一部分纖維特異性地與第Ⅶ(中間外側(cè)核、中間內(nèi)側(cè)核)、Ⅵ、Ⅴ等與內(nèi)臟支配有關(guān)的板層發(fā)生突觸聯(lián)系,形成兩穴配伍在脊髓層次的整合,從而實現(xiàn)對胃等內(nèi)臟器官功能的調(diào)節(jié)作用。

3.4 關(guān)于內(nèi)關(guān)、公孫兩穴配伍對胃等內(nèi)臟的調(diào)節(jié)作用自Ellison和Clark[6]成功地將HRP示蹤技術(shù)應(yīng)用于內(nèi)臟神經(jīng)以來,國內(nèi)外已有不少有關(guān)胃等內(nèi)臟的神經(jīng)支配報道,并在包括孤束核在內(nèi)的不同節(jié)段追蹤到HRP陽性標(biāo)記細(xì)胞。孤束核(Sol)是延髓內(nèi)重要的內(nèi)臟感覺性核團(tuán),為一般內(nèi)臟感覺傳導(dǎo)通路上的第一級中繼站。隨著神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)研究方法的不斷發(fā)展,人們對孤束核的認(rèn)識日趨深入,近年來HRP法以及還原銀染技術(shù)對有關(guān)孤束核的大量研究證實了孤束核不但與脊髓、腦干具有傳入、傳出神經(jīng)聯(lián)系,而且與高級中樞(前腦、小腦)也具有復(fù)雜的往返聯(lián)系[7]。Lowey認(rèn)為孤束核向脊髓的投射主要起自孤束核的中間內(nèi)側(cè)核、腹外側(cè)核、聯(lián)合核[8]。而孟氏用HRP法證實了脊髓灰質(zhì)Ⅲ～Ⅶ、Ⅹ板層向孤束核內(nèi)側(cè)部直接投射[9]。本實驗可見到"內(nèi)關(guān)"、"公孫"兩穴配伍電針后,兩穴的陽性標(biāo)記運(yùn)動神經(jīng)元樹突野延伸至Ⅶ、Ⅵ、Ⅴ板層,并特異性地與中間外側(cè)核、中間內(nèi)側(cè)核聯(lián)系。因此推測內(nèi)關(guān)、公孫與胃等內(nèi)臟之間可能存在著內(nèi)關(guān)、公孫→軀體傳入神經(jīng)→第Ⅸ板層→第Ⅶ、Ⅵ、Ⅴ板層,中間外側(cè)核、中間內(nèi)側(cè)核→孤束核→交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)→胃等內(nèi)臟的調(diào)節(jié)關(guān)系。

胃壁注射CB睭RP是對胃的病理性刺激,其傳入應(yīng)比生理狀態(tài)下增加,而配伍電針內(nèi)關(guān)、公孫后,可見孤束核內(nèi)陽性標(biāo)記細(xì)胞顯著減少,正說明了內(nèi)關(guān)、公孫配伍可對病理狀態(tài)下胃等內(nèi)臟的中樞傳入起顯著地抑制性作用;而當(dāng)胃等內(nèi)臟功能活動減弱時,內(nèi)關(guān)、公孫配伍針刺又可以興奮孤束核內(nèi)相應(yīng)神經(jīng)元以增加交感和副交感神經(jīng)對內(nèi)臟的傳出沖動,從而實現(xiàn)對胃等內(nèi)臟功能的雙向調(diào)節(jié)作用。內(nèi)關(guān)和公孫之間通過脊髓的中間內(nèi)、外側(cè)核神經(jīng)元纖維的相互影響,實現(xiàn)特異的增加效應(yīng),這可能是兩穴配伍運(yùn)用能增強(qiáng)臨床效果的機(jī)制所在,而孤束核則起著實現(xiàn)兩穴對胃等內(nèi)臟調(diào)節(jié)的中樞整合作用。

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