李淑彬, 黃 娟, 周仁超, 李澤恩, 徐詩如, 阮 婷, 龐啟華

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510631

南藥植物高良姜內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其促生潛力

李淑彬*, 黃 娟, 周仁超, 李澤恩, 徐詩如, 阮 婷, 龐啟華

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510631

以道地產(chǎn)地高良姜為材料，對該藥用植物內(nèi)生細(xì)菌種群組成、組織分布及其促生潛力進(jìn)行了研究。采用組織塊分離法，從高良姜根、根莖、莖和葉4個組織共計分離得到細(xì)菌136株，分屬于16個16S rDNA基因型、12個細(xì)菌屬、15個細(xì)菌種，其中，芽孢桿菌、甲基桿菌分別為其最、次優(yōu)勢種群。各種群分離比隨組織不同而異；采用HhaI 消化的末端限制性片段多態(tài)性(T-RFLP) 免培養(yǎng)方法，從高良姜4個組織共計檢測到36個不同的末端限制性酶切片段(T-RFs)。種群對應(yīng)分析表明其免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體主要包括芽孢桿菌、甲基桿菌等高抗性細(xì)菌，海洋螺菌、紅桿菌、交替假單胞菌等海洋細(xì)菌及熱帶根瘤菌、沼澤考克氏菌等熱帶相關(guān)細(xì)菌，說明高良姜內(nèi)生細(xì)菌群體與其宿主植物生長環(huán)境密切相關(guān)。不同組織其總T-RFs數(shù)目、優(yōu)勢T-RFs及其對應(yīng)細(xì)菌種群明顯不同；在所分離的細(xì)菌菌株中，36.36%、51.52%、54.55%和27.27%的菌株分別顯示了胞外幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶，生長素及其1-氨基環(huán)丙烷- 1-羧酸(ACC)脫氨酶產(chǎn)生能力。其中，泛菌L- 2、芽孢桿菌S- 16所測4個指標(biāo)均為陽性，熱帶根瘤菌菌株R- 1和 R- 3顯示了較高的ACC脫氨酶及生長素產(chǎn)生能力，這些菌株是促生菌劑的良好候選。

道地高良姜; 內(nèi)生細(xì)菌; 分離培養(yǎng); T-RFLP; 植物促生作用

植物內(nèi)生細(xì)菌(Endophytic bacteria)存在于植物內(nèi)部，其種群組成與其宿主植物種及其基因型、組織類型、發(fā)育階段、及植株生長環(huán)境密切相關(guān)[1- 6]。大量研究顯示內(nèi)生細(xì)菌可通過固氮作用、分泌生長素、產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷- 1-羧酸脫氨酶、鐵載體、抗生素等多種方式促進(jìn)植物生長、提高其對生物及非生物境脅迫的抗性[1- 8]。研究植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性及功能活性，對闡明植物-內(nèi)生細(xì)菌相互作用、有效利用內(nèi)生細(xì)菌資源具有重要意義。

高良姜(AlpiniaofficinarumHance)，別名小良姜，又名徐聞良姜，是著名南藥植物之一[9]。高良姜提取物具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗癌、保護(hù)心腦血管等活性[9- 13]，已廣泛用于食品和藥品添加劑的制備。高良姜在熱帶、亞熱帶均有分布，其中，以廣東省湛江市徐聞縣龍?zhí)伶?zhèn)所產(chǎn)高良姜質(zhì)量最優(yōu)，為道地高良姜[9]。高良姜含有多種活性組分，其道地產(chǎn)地位于我國最南端高溫高濕、強(qiáng)輻射、低pH值的海岸環(huán)境，在這樣的環(huán)境其內(nèi)生菌多樣性特征可能不同于內(nèi)陸植物。然而，有關(guān)高良姜內(nèi)生菌的研究國內(nèi)外尚未報道。本論文以道地產(chǎn)地高良姜為材料，采用分離培養(yǎng)方法、及基于末端限制性片段長度多態(tài)性分析(terminal-restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)的免培養(yǎng)方法對其內(nèi)生細(xì)菌多樣性、組織分布及其抗逆促生潛力進(jìn)行了研究，以期了解該藥用植物內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)和生態(tài)分布特點，為分析內(nèi)生菌群體在其道地性形成中的作用、及內(nèi)生細(xì)菌資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗所用高良姜均采自道地高良姜產(chǎn)地廣東省徐聞縣龍?zhí)伶?zhèn)。整株挖取健壯、無病蟲害、約4年生植株，用滅菌物品袋包裹帶回實驗室后立即進(jìn)行內(nèi)生菌分離及組織DNA提取。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

1-氨基環(huán)丙烷- 1-羧酸(1-aminocyclopropane- 1-carboxylic acid, ACC)、β-葡聚糖、幾丁質(zhì)購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶HhaI、MspI, Premix Taq、pMD18-T購于Takara公司；Dzup(植物)基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒購于上海生工生物科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar, NA)、Luria-Bertani 培養(yǎng)基(LB)、胰蛋白胨培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；膠態(tài)幾丁質(zhì)培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[14]、剛果紅-葡聚糖培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[15]、無氮培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基(supplemental medium, SM)參照文獻(xiàn)[16]配制。SMA 培養(yǎng)基: 向SM 培養(yǎng)基中添加過濾除菌的ACC，使其終濃度為3 mmol /L[7]。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

用流水沖洗高良姜根、根莖、莖和葉樣品，吸干水分。根莖、根用無菌小刀刮去表皮，切成長、寬、厚各約2 mm小塊。剝?nèi)ケ韺拥那o、及葉切成長、寬各約2 mm小段。按照以下步驟對上述樣品進(jìn)行表面消毒：75%酒精浸泡30 s—無菌水沖洗3次—0.1%升汞浸泡4 min—無菌水沖洗5次。取表面消毒的組織小塊(60塊/組織)貼于預(yù)先制備的NA平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，對出現(xiàn)的所有菌落進(jìn)行劃線純化，經(jīng)鏡檢后, 純菌落轉(zhuǎn)接于NA斜面保存。最后1次消毒無菌水涂布于同樣的平板以檢測消毒效果。

1.4 菌株16S rDNA擴(kuò)增及限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism， RFLP)分析

菌株接入LB培養(yǎng)液中30 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，離心 (4000 r/min) 收集菌體，用TE 洗滌3次, 用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA, 方法參見試劑盒說明書。以提取的各DNA為模板，用細(xì)菌通用引物27F /1492R擴(kuò)增菌株16S rDNA 序列。每25 μL PCR 反應(yīng)混合物含Premix Taq 12.5 μL，正、反引物各1 μL、模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。切膠回收目標(biāo)產(chǎn)物(—1500 bp)，用DNA純化試劑盒純化。純化產(chǎn)物分別用HhaI、MspI 于37 ℃消化3 h (酶切體系含PCR 產(chǎn)物2 μL, 酶1 μL, 10 × M buffer 2 μL, ddH2O 15 μL)，75 ℃下水浴10 min終止消化。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測消化產(chǎn)物，根據(jù)其電泳條帶數(shù)目及相對大小進(jìn)行RFLP圖譜分型。對兩種酶RFLP圖譜進(jìn)行組合，在兩種圖譜中DNA條帶數(shù)目及其相對大小均相同的菌株定義為同一16S rDNA基因型 (rDNA type)。

1.5 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

選取各基因型中代表菌株16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5-α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆委托深圳華大基因有限公司測序。所有有效序列用核糖體數(shù)據(jù)庫的分類程序進(jìn)行屬級或以上種群歸類；在NCBI進(jìn)行Blast 同源性搜索，獲得相近序列，Clustal X 多重比對后，運用MEGA 5.05 軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)樹，boostrap 1000次檢測各分支的置信值。

1.6 免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體的T-RFLP分析

取各組織表面消毒后的組織小塊(10塊/組織)，用Dzup(植物)基因組DNA提取試劑盒提取各組織總DNA，方法參見試劑盒說明書。以組織總DNA為模板，采用正向引物5′端用6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標(biāo)記的27F/1492R引物對擴(kuò)增組織16S rDNA序列，PCR反應(yīng)體系和程序同1.4?；厥疹A(yù)期產(chǎn)物 (—1500 bp)，試劑盒純化后用HhaI消化。酶切條件及體系同1.4。消化終止后，將管壁用錫箔紙包裹，送深圳華大基因有限公司進(jìn)行T-RFLP分析。T-RFLP圖譜中末端限制性片段(Terminal-Restriction Fragment, T-RF)范圍在50—550 bp、熒光強(qiáng)度高于100 U、在平行實驗圖譜中重復(fù)再現(xiàn)的峰納入統(tǒng)計分析。合并片段大小±1 bp的T-RFs。計算每一T-RF在其對應(yīng)樣品中的相對豐度[17]，相對豐度 > 5%的T-RFs定義為該樣品的優(yōu)勢T-RFs。按照同樣方法檢測分離菌株對應(yīng)的T-RFs。通過網(wǎng)站(http://trflp.limnology.wisc.edu/index.jsp) 檢索未對應(yīng)的T-RFs可能代表的細(xì)菌類群。每一組織3個平行分析。

1.7 內(nèi)生細(xì)菌抗逆促生潛力的測定

幾丁質(zhì)酶測定參照文獻(xiàn)[14]方法。1個幾丁質(zhì)酶活力單位定義為: 在測定的反應(yīng)條件下, 每min生成1 μmol N-乙酰葡萄糖所需要的酶量；β-葡聚糖酶測定參照文獻(xiàn)[15]方法。1個β-葡聚糖酶活力單位定義為: 在測定的反應(yīng)條件下, 每min生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量；生長素產(chǎn)生潛力的測參照文獻(xiàn)[5]方法通過與Salkowski 顯色液的顯色反應(yīng)測定；ACC 脫氨酶測定參照文獻(xiàn)[16]方法。1個ACC 脫氨酶酶活單位定義為：在測定的反應(yīng)條件下, 每h生成1 μmol α-丁酮酸所需的酶量；上述每一樣品每一測定3個重復(fù)。

1.8 免培養(yǎng)細(xì)菌群體多樣性指數(shù)與差異分析

以T-RFLP圖譜中各T-RFs相對豐度計算免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)：

H=-∑(PilnPi)

式中，Pi為第i個T-RF在該組織豐度；使用SPSS 17.0軟件中的鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan′s Multiple Ranger Test) 進(jìn)行差異顯著性分析(P< 0.05，n=3)。

2 結(jié)果

2.1 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌 RFLP 分型與種群分析

圖1 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA RFLP 分型檢測

本研究從高良姜根、根莖、莖和葉4個組織共計240個組織塊中分離獲得136株能穩(wěn)定傳代的細(xì)菌菌株，其編號見表1。其中, 根38株, 根莖24株、莖32株, 葉42株。擴(kuò)增所有菌株16S rDNA基因序列，PCR 產(chǎn)物 (— 1500 bp) 經(jīng)HhaI、MspI 分別消化得到的酶切圖譜 (圖1) 組合后共獲得16種不同基因型(表1)。其中，根所分離菌株分布于基因型1—7、10—12及15—16中，根莖所分離菌株分布于基因型1—7中，莖所分離菌株分布于基因型1—7、及基因型10、12、13、14、和16中，葉分離菌株其基因型最多，共計14種，除基因型15、16外其他各基因型均有分布。這些結(jié)果說明高良姜可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群組成在不同組織中存在明顯差異。

從各基因型中隨機(jī)選取1—3個代表菌株進(jìn)行16S rDNA 全序列測定，獲得的正反向序列經(jīng)拼接比對后大小為1345—1497 bp。序列提交至Genbank 獲得的檢索號顯示在圖2?；诤颂求w數(shù)據(jù)庫歸類，這些序列歸于芽孢桿菌屬(Bacillus)、考克氏菌屬(Kocuria)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、伯霍爾德菌屬(Burkholderia)、沙雷菌屬(Serratia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、泛菌屬(Pantoea)、及鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)等12個不同的細(xì)菌屬(表1)。

表1 高良姜可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA 基因型及其系統(tǒng)發(fā)育地位Table 1 16S rDNA types of endophytic bacteria isolated from A. officinarum Hance and their phylogenetic position

*表示測序的代表菌株; RDP: Ribosomal database project

用Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對這些序列進(jìn)行進(jìn)一步的屬、種歸類。結(jié)果顯示芽孢桿菌屬中的菌株分別與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和堅硬芽孢桿菌(Bacillusfirmus)構(gòu)成同一分支；其他各屬菌株與沼澤考克氏菌(Kocuriapalustris)、熱帶根瘤菌(Rhizobiumtropici)、嗜有機(jī)甲基桿菌(Methylobacteriumorganophilum)等12個不同種的細(xì)菌顯示了最近的進(jìn)化距離(圖2)。屬級或以上水平，核糖體聚類及進(jìn)化樹分析結(jié)果完全一致。

圖2 高良姜內(nèi)生細(xì)菌代表性菌株16s rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體的組織差異

圖3 高良姜不同組織可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群組成

根據(jù)各基因型菌株分離比及對應(yīng)的細(xì)菌種群，計算高良姜不同組織可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群組成(屬水平)，結(jié)果如圖3。從圖3可知，從其根莖得到的菌株僅分布在芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬和考克氏菌屬等4個屬，以芽孢桿菌屬最為優(yōu)勢(分離比達(dá)75%)；根中分離的菌株分屬于9個不同的細(xì)菌屬，芽孢桿菌同樣為其最優(yōu)勢種群(分離比23.68%)，鞘氨醇單胞菌、及沙雷氏菌并列為該組織次優(yōu)勢種群；莖、葉中分離的菌株均以甲基桿菌最高，芽孢桿菌次之。盡管莖、葉兩個組織最優(yōu)勢、及次優(yōu)勢種群相同，其他種群存在大的差異。此外，幾個種群顯示了一定程度的組織喜好性，如根瘤菌僅從單一組織根中分離，泛菌僅從葉中分離，假單胞菌僅從根和葉中分離，而甲基桿菌僅從兩個地上組織莖和葉中分離。

2.3 免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體T-RFLP分析

采用HhaI 單酶消化的T-RFLP方法分析高良姜免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體，得到的T-RFLP圖譜顯示在圖4。從其根、根莖、莖和葉四個不同組織總共檢測到36個相對豐度大于1%的末端限制性酶切片段(T-RFs)。按照1個T-RFs至少代表1種細(xì)菌，高良姜免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體至少組成36個不同的細(xì)菌種，說明高良姜免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性。

圖4 高良姜不同組織內(nèi)生細(xì)菌群體T-RFLP指紋圖譜

對所有分離菌株的16S rDNA序列進(jìn)行了T-RFLP分析，總共檢測到17個HhaI消化的T-RFs，為直接組織檢測到T-RFs總數(shù)的47.22%，說明高良姜內(nèi)生細(xì)菌群體中有相當(dāng)多的種群難以用普通的培養(yǎng)方法培養(yǎng)。通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索分析，19個未從分離菌株檢測到的T-RFs中，14個分別對應(yīng)于海洋螺菌目(Oceanospirillales)、交替假單胞菌目(Pseudomonadales)、弧菌目(Vibrionales)、紅桿菌目(Rhodobacterales)及腸桿菌目(Enterobacteriales)。而另外5個T-RFs沒有在相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫中檢索到，為未分類的T-RFs。

分析不同組織T-RFLP圖譜，可知其總T-RFs數(shù)目、優(yōu)勢T-RFs及其對應(yīng)種群隨組織而異(圖4, 表2)?；诟鹘M織所檢測的T-RFs及其相對豐度，計算不同組織免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，結(jié)果如表2，不同組織該多樣性指數(shù)存在顯著差異(P< 0.05)，以根莖最低，葉最高，根和莖次之。

表2 高良姜不同組織免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和優(yōu)勢T-RFs及其對應(yīng)種群

Table 2 Shannon-Wiener diversity index，as well as dominat T-RFs and responding taxa of culture-independence bacterial endophyte commimniuties detected from various tissues ofA.officinarumHance

組織TissueShannon-Wiener多樣性指數(shù)Shannon-Wienerdiversityindex優(yōu)勢T-RFs(bp)及其對應(yīng)種群(屬級或以上水平)DominatT-RFs(bp)andrepresentingtaxaatgenralevelorabove根Root2.67±0.02c44(Oceanospirillales);*62(Rhizobium);74(Sphingomonas);249(Unclassfied);306,500(Rhodobacterales);*401(Bacillus)根莖Rhizome1.46±0.06b44(Oceanospirillales);82(Unclassfied);*404(Bacillus);*222(Brevibacillus)莖Stem2.48±0.04d47(Alteromonadales);*68(Methylobacterium);71(Unclassfied);*74(Sphingomonas);*404(Bacillus)葉Leaf2.88±0.02ba41,*50(Enterobacteriales);*68(Methylobacterium);*456(Kocuria)247,249(Unclassfied);*404,*404(Bacillus);444(Vibrionales)

* 代表從所分離菌株中檢測; 不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(P< 0.05,n=3)

2.4 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌抗逆促生潛力菌株的篩選

對部分所分離的細(xì)菌菌株進(jìn)行了幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、ACC脫氨酶和生長素產(chǎn)生能力的測定，其結(jié)果綜合如表3。在所測試的4個抗逆促生活性指標(biāo)中，絕大多數(shù)菌株(29/33)至少顯示了1種陽性結(jié)果。其中，12個(36.36%)菌株顯示幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生潛力，其酶產(chǎn)率變化在0.58—3.32 U/mL之間，以芽孢桿菌RZ- 6產(chǎn)率最高；17個(51.52%)菌株顯示了葡聚糖酶產(chǎn)生能力，以芽孢桿菌S- 16產(chǎn)率最高，達(dá)31.3±1.22 U/mL。其他葡聚糖酶產(chǎn)生能力較強(qiáng)的菌株包括：泛菌L- 2、考克氏菌RZ- 22、甲基桿菌L- 21及芽孢桿菌RZ- 9等；分泌生長素產(chǎn)生篩選中，18個(54.55%)菌株顯示了陽性結(jié)果，包括：甲基桿菌3株，芽孢桿菌3株，沙雷氏菌、根瘤菌、假單胞菌和泛菌各2株，伯霍爾德菌、類芽孢桿菌和檸檬酸桿菌各1株。其中假單胞菌菌株L- 20其生長素產(chǎn)率高達(dá)(31.58±2.35) μg/mL；33個菌株中，9個(27. 27%)菌株能在以ACC為唯一氮源培養(yǎng)基中生長，包括：根瘤菌2株、芽孢桿菌2株、鞘氨醇單胞菌1株、甲基桿菌2株、泛菌1株，以根瘤菌RZ- 1 ACC脫氨酶產(chǎn)率最高((2.67±0.27) U/mg菌體)。

表3 高良姜內(nèi)生細(xì)菌幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、ACC脫氨酶、生長素產(chǎn)生菌的篩選

Table 3 Screening for production of chitinase，β-glucanase, ACC deaminase, and IAA by bacterial endophytes fromA.officinarumHance

菌株Strain幾丁質(zhì)酶Chitinase/(U/mL)葡聚糖酶β-glucanase/(U/mL)吲哚乙酸IAA/(μg/mL)ACC脫氨酶(U/mg菌體)ACCdeaminase/(U/mgcell)R-118.56±1.112.67±0.27R-323.33±2.192.16±0.15R-51.38±0.22R-141.75±0.34R-159.87±35R-172.39±0.3411.48±0.94R-220.82±0.495.94±0.252.03±0.11R-240.58±0.317.64±0.891.38±0.11R-290.98±0.0421.56±1.27RZ-2214.68±1.25RZ-11.37±0.23RZ-713.57±0.59RZ-90.96±0.2816.35±0.6618.21±2.53RZ-63.32±0.343.42±0.1714.29±1.18S-56.55±0.62S-1814.68±1.710.89±0.09S-260.74±0.12S-31.35±0.114.46±0.089.27±1.01S-298.73±0.555.54±0.16S-12.14±0.123.53±0.2424.37±2.12S-163.32±0.0931.3±1.2229.54±0.370.74±0.12S-111.35±0.44L-2119.82±0.4122.33±1.25L-378.37±0.698.25±0.49L-305.37±0.35L-201.67±0.2931.58±2.35L-22.46±0.0826.24±0.9525.53±1.691.38±0.11L-437.56±0.45L-41.37±0.49

-: 測定為陰性結(jié)果；數(shù)據(jù)為每一測定3個重復(fù)的平均值; IAA: Indoleacetic acid; ACC: 1-aminocyclopropane- 1-carboxylic acid

3 討論

采用分離培養(yǎng)方法，本研究從道地高良姜分離得到的內(nèi)生細(xì)菌歸于16個不同的基因型、12個不同的細(xì)菌屬(表1，圖1, 圖2)，表明高良姜可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體具有豐富的種群多樣性和遺傳多樣性。在本研究中，芽孢桿菌從所有組織中得到且具有很高的分離比, 屬于該植物可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌最優(yōu)勢類群，而甲基桿菌為其第二大優(yōu)勢類群(圖3)。此外，熱帶根瘤菌和沼澤考克氏菌也具有較高的分離比，而一些土壤中常見的類群如假單胞菌等其分離比相對較低(圖3)。高良姜可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體這種種群組成特征可能與該植物含有多種具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物、且該植物生長于高溫高濕、低pH值、高輻射的近海岸地區(qū)有關(guān)。芽孢桿菌能形成高抗逆性芽孢，甲基桿菌能在寡營養(yǎng)環(huán)境中生長，且大多具有較強(qiáng)的抗輻射和抗?jié)B透壓力[18]，該2類細(xì)菌高的抗逆能力使之能在高良姜組織定植和生存繁殖中更具競爭力。而現(xiàn)有文獻(xiàn)報導(dǎo)的熱帶根瘤菌、沼澤考克氏菌主要分離自熱帶植物、熱帶土壤及海底沉積物中，該兩個種群具有良好的低pH、高溫抗性，及多種化學(xué)污染物抗性[19,20]。

分離培養(yǎng)是獲得生物活性菌株的基礎(chǔ)。然而，由于大量細(xì)菌具有不可培養(yǎng)性及分離培養(yǎng)具有強(qiáng)烈的選擇性，使培養(yǎng)得到的內(nèi)生菌不能完全反應(yīng)自然狀態(tài)下內(nèi)生菌群落的真實情況。T-RFLP技術(shù)綜合運用PCR技術(shù)、限制性酶切技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)和DNA序列自動分析技術(shù)，不僅可定性評估群體中微生物種群數(shù)量，而且可定量反映樣品中的各類群豐度，在國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于研究多種生境包括土壤、水域及其沉積物，動、植物體表及內(nèi)部組織微生物群體多樣性及其動態(tài)變化[17,21- 24]。本研究采用T-RFLP技術(shù)進(jìn)一步分析了高良姜免培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群體的多樣性及其組織分布，結(jié)果顯示與海洋螺菌、紅桿菌、交替假單胞菌等海洋細(xì)菌及熱帶根瘤菌、沼澤考克氏菌等相關(guān)的的T-RFs在高良姜多個組織中檢出，且具高的相對豐度(表2，圖4)，這個結(jié)果進(jìn)一步說明該宿主植物生長環(huán)境是影響其內(nèi)生菌種群組成的重要因素。比較培養(yǎng)方法與免培養(yǎng)方法所得結(jié)果，發(fā)現(xiàn)較之可培養(yǎng)細(xì)菌群體，其免培養(yǎng)群體種群多樣性更為豐富(表2)，且免培養(yǎng)檢測到的細(xì)菌群體中有近50%的種群沒有被分離到。為了更全面了解可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性，有必要對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行更為細(xì)致的研究。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)5個T-RFs既沒有在所分離菌株中檢測到，也沒有在相關(guān)數(shù)據(jù)庫中檢索到，這5個T-RFs所對應(yīng)的序列有如下兩個可能： 1)未培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列。由于目前已登錄T-RFLP數(shù)據(jù)庫的細(xì)菌T-RFs非常有限，所以未能查到其對應(yīng)的細(xì)菌種群；2)植物葉綠體或線粒體的rDNA序列。植物葉綠體16S rDNA 和線粒體18S rDNA序列同細(xì)菌16S rDNA 高度同源，用細(xì)菌16S rDNA通用引物也可能導(dǎo)致植物組織中葉綠體或線粒體rDNA序列的擴(kuò)增。由于目前尚無對應(yīng)于植物葉綠體或線粒體rDNA序列的T-RFLP數(shù)據(jù)，目前所檢測到的5個未分類T-RFs是否來源于植物細(xì)胞器，有待進(jìn)一步研究。

分離培養(yǎng)方法及T-RFLP方法結(jié)果均顯示高良姜內(nèi)生細(xì)菌群體具有明顯的組織差異(圖3，表2)，這可能與該藥用植物活性代謝產(chǎn)物在不同組織中的累積差異有關(guān)。在相關(guān)研究中，測定了道地高良姜4個不同組織3種指標(biāo)性成分總揮發(fā)油、1，8-桉油精以及高良姜素的含量，結(jié)果顯示， 4個不同組織中3種指標(biāo)性成分含量存在較大差異(詳情另見文報道)。研究已經(jīng)顯示這些成分均具有廣譜的抗菌活性[9- 12]。群體中不同細(xì)菌種群對這些物質(zhì)的耐(抗)性可能不同，因而在該植物不同組織的生存和生長能力不同。對植物內(nèi)生菌的研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌種群在某些植物中具有一定的組織專一性或喜好性。如具有重要促生作用的內(nèi)生性泛菌在水稻中主要在葉和種子中分離[6]，內(nèi)生性的甲基桿菌主要從植物莖和葉分離[6,8]。這些特定種群對植物組織偏好型機(jī)理目前尚未有深入的研究和認(rèn)識。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)某些種群在高良姜植株內(nèi)具有一定程度的偏好性，如泛菌僅在其葉片中分離，而甲基桿菌也僅在兩個地上組織中分離。未培養(yǎng)群體中，對應(yīng)于紅桿菌的T-RFs在根中具有較高的豐度，而在其他組織豐度很低甚至沒有檢出，這個結(jié)果提示植物內(nèi)化學(xué)環(huán)境的組織差異可能是內(nèi)生細(xì)菌組織偏好型的一個可能因素。從另一角度，內(nèi)生細(xì)菌生長于植物內(nèi)部組織，由于基因轉(zhuǎn)移及對內(nèi)化學(xué)環(huán)境適應(yīng)，內(nèi)生菌可獲得直接合成這些代謝產(chǎn)物、或促進(jìn)其生物轉(zhuǎn)化的能力，因而，內(nèi)生細(xì)菌種群在高良姜組織間的差異可能也是導(dǎo)致該植物不同組織間活性代謝產(chǎn)物含量差異的原因之一。

幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶是與植物抗病防衛(wèi)密切相關(guān)的水解酶，生長素可直接促進(jìn)植物生長。產(chǎn)ACC脫氨酶的內(nèi)生細(xì)菌能平衡植物因脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的乙烯，從而間接促進(jìn)植物根系延長和植株發(fā)育，在提高植物抗旱、澇、鹽、病和重金屬等壓力脅迫中具有重要作用[1,6- 8,25]。在本研究所測試的菌株中，36.36%、51.52%、54.56%和27.27%的菌株分別具有胞外幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶，生長素及其ACC脫氨酶產(chǎn)生能力。特別是泛菌L- 2和芽孢桿菌 S- 16所測4個指標(biāo)均為陽性(表3)，是生防菌劑及生物肥料的良好候選；此外，熱帶根瘤菌菌株R- 1、R- 3 顯示了最高的ACC脫氨酶產(chǎn)生及相對高的生長素產(chǎn)生能力(表3)。熱帶根瘤菌是已報道的極具應(yīng)用價值的固氮菌，其與多種熱帶豆科植物具有高的結(jié)瘤能力，且對低pH、高溫，及多種殺蟲劑具有強(qiáng)的抗性[20]，菌株R- 1、R- 3是促生菌劑的良好候選。

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Diversity and plant growth-promoting potential of bacterial endophytes ofAlpiniaOfficinarumHance, a famous south-China medicinal plant

LI Shubin*, HUANG Juan, ZHOU Renchao, LI Ze′en, XU Shiru, RUAN Ting, PANG Qihua

CollegeofLifeScience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou510631,China

AlpiniaofficinarumHance, which is a species of the familyZingiberaceae, is a perennial medicinal plant that is mainly distributed in the tropical and subtropical regions of Southeast Asia. Although the endophytic communities of various crop plants and several medicinal plants have been investigated, no publications have reported research related to the endophytes ofA.officinarumHance. In the present study, a culture-dependent method combined with a terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) technique-based culture-independent method were applied to assess the diversity of the culturable bacterial endophyte communities and total bacterial endophyte communities ofA.officinarumHance. Using the culture-dependent isolation method, 136 bacterial isolates were obtained from the internal tissues of root, rhizome, stem, and leaf of healthy, 4-year-oldA.officinarumHance plants collected from Longtang Town in Xuwen County, Guangdong Province, China. We selected theA.officinarumHance plants growing in this area because the quality and pharmacological effects of these medicinal plants growing in this area are traditionally considered to be significantly higher than those of any other areas of China. Based on 16S rDNA sequence analysis, the bacterial isolates represented 16 distinct 16S rDNA gene types, 12 distinct bacterial genera, and 15 distinct bacterial species. The most dominant bacterial population was the genusBacillus, followed byMethylobacterium. The culturable bacterial communities that were obtained from the different tissues of the medicinal plant were significantly different, and several bacterial populations displayed some level of tissue preference in the host plant. Using the T-RFLP-based culture-independent method, 36 distinct Terminal-Restriction Fragments (T-RFs) were detected from the amplified,HhaI mono-digestion-targeted 16S rDNA gene sequences from internal tissues of the root, rhizome, stem, and leaf ofA.officinarumHance plants collected from the same sites. The corresponding taxons of the dominant T-RFs were linked to highly resistantBacillusandMethylobacterium, as well as several marine bacterial orders, such as Oceanospirillales, Pseudomonadales, Vibrionales, and Rhodobacterales, which indicated that the population composition of the total bacterial endophyte community inA.officinarumHance was significantly correlated with the environment of the host. The numbers of total T-RFs, the dominant T-RFs, and their corresponding taxons were significantly different between tissues ofA.officinarumHance. These observations indicated that the tissue types ofA.OfficinarumHance could contribute to the variation in the bacterial endophyte communities of the plant. Furthermore, the isolated bacterial endophytes were screened for a panel of beneficial effects that included the production of extracellular chitinase and β-glucanase, indoleacetic acid (IAA), as well as 1-aminocyclopropane- 1-carboxylic acid (ACC) deaminase. Many of the strains displayed positive results in these assays (chitinases: 36.36%, β-glucanase: 51.52%, IAA: 54.55%, ACC deaminase: 27.27%). In particular, the isolates L- 2, which was assigned to thePantonesp., and S- 16, which was assigned to theBacillussp., were capable of co-producing chitinases, β-glucanase, IAA, and ACC deaminase, and are potential candidates for use as biocontrol agents and in biofertilizers. In addition, two isolates (R- 1, R- 3) that were assigned toRhizobiumtropicicould produce IAA and ACC deaminase; therefore, they are good candidates for use as plant growth-promoting bacteria.

AlpiniaofficinarumHance; bacterial endophytes; culture-dependent method; T-RFLP technique; plant growth-promoting potential

國家自然科學(xué)基金資助項目(31070003); 廣州市科技計劃項目(2013J4100050)

2013- 12- 11;

2014- 08- 13

10.5846/stxb201312112929

*通訊作者Corresponding author.E-mail: shuli_1990@126.com

李淑彬, 黃娟, 周仁超, 李澤恩, 徐詩如, 阮婷, 龐啟華.南藥植物高良姜內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其促生潛力.生態(tài)學(xué)報,2015,35(10):3204- 3213.

Li S B, Huang J, Zhou R C, Li Z E, Xu S R, Ruan T, Pang Q H.Diversity and plant growth-promoting potential of bacterial endophytes ofAlpiniaOfficinarumHance, a famous south-China medicinal plant.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3204- 3213.