曹少奇，陳巖，高新梅，喻恒彬，王靜*，胡廣東*

（ 1.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，新疆 烏魯木齊 830000 ； 2.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832061 ）

和田羊是歷史悠久的地方半粗毛羊品種，但由于育種工作落后，導(dǎo)致生產(chǎn)性能發(fā)生退化。因此，對控制和田羊羊毛的性狀相關(guān)基因進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步改善和田羊的羊毛品質(zhì)，對和田羊種質(zhì)資源的開發(fā)與保護(hù)具有重要意義[1]。毛囊是支持哺乳動物毛發(fā)形成和生長的重要器官，其周期受血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子[2]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4[3]、胰島素樣生長因子1[4]、FGF5[5]等多種信號分子的調(diào)控，F(xiàn)GF5是控制毛囊從生長期向退行期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子[6]。FGF5由3個外顯子和兩個內(nèi)含子構(gòu)成，具有調(diào)控毛囊周期的功能，是調(diào)節(jié)毛發(fā)生長的重要因子之一。在對小鼠、驢、犬、貓、人的試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)FGF5基因的表達(dá)量與毛發(fā)生長有關(guān)，也有研究發(fā)現(xiàn)FGF5基因的表達(dá)與絨山羊的羊絨生長有關(guān)[7]。綜上，沉默或敲除FGF5因子研究其對動物產(chǎn)毛性狀的影響，對提高產(chǎn)毛動物的毛產(chǎn)量具有重要意義。

對絨山羊中使用RNAi技術(shù)進(jìn)行FGF5敲除試驗(yàn)，結(jié)果表明，RNAi技術(shù)可有效降低FGF5的表達(dá)[8-9]，且FGF5敲除后對絨山羊的血液生理生化指標(biāo)[10]、發(fā)情能力[11]無顯著影響。本研究中設(shè)計(jì)并合成了4個shRNA，將其與pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒連接構(gòu)建干擾表達(dá)載體，將干擾載體轉(zhuǎn)染至和田羊成纖維細(xì)胞，檢測其對和田羊FGF5基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平的干擾效率，篩選出干擾效率最強(qiáng)的shRNA，為進(jìn)一步探討和田羊中FGF5基因的作用機(jī)制、改善和田羊毛質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用和田羊由石河子大學(xué)獸醫(yī)站飼養(yǎng)，剪取和田羊耳部組織分離培養(yǎng)獲得成纖維細(xì)胞。

大腸桿菌DH5α購自天根公司；質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo購自上海吉瑪技術(shù)有限公司。

胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自Gibco；20×PBS、質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；青霉素-鏈霉素（HyClone）；Trizol（Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）；抗GADPH鼠單克隆抗體、抗FGF5鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（Abcam公司）。

CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）、超凈工作臺（日本日立公司）、LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏公司）；垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀（美國BIO-RAD公司）；水平板電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 和田羊FGF5基因靶向寡核苷酸的設(shè)計(jì)與制備

依據(jù)和田羊FGF5基因CDS區(qū)與shRNA的設(shè)計(jì)原則，使用Life Technologies公司網(wǎng)站（http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/brands/ambion.html）中的shRNA target design工具，設(shè)計(jì)得到4條長度為54 bp的shRNA干擾片段PR-FGF1、PR-FGF2、PR-FGF3、PR-FGF4和1條長度為51 bp的陰性對照片段PR-FGF5，片段序列信息見表1。

表1 FGF5 RNA干擾片段序列信息Tab.1 FGF5 RNA interference fragment sequence information

shRNA干擾片段上下游分別引入BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)和Bbs Ⅰ酶切位點(diǎn)，由上海生工生物工程有限公司合成相應(yīng)的shDNA單鏈。

1.3 RNA干擾載體的構(gòu)建

將所得的單鏈shDNA使用20 μL體系（Sense 1 μL、10×SSC 1 μL、Anti-Sence 1 μL、ddH2O補(bǔ)齊）進(jìn)行退火連接；反應(yīng)條件為95 ℃變性10 min，室溫冷卻1 h；獲得雙鏈shDNA。

4條干擾片段分別命名為shRNA-FGF1、shRNAFGF2、shRNA-FGF3、shRNA-FGF4，陰性對照片段命名為shRNA-FGF5。使用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Bbs Ⅰ對質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo進(jìn)行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，得到線性化的質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo。將合成的5條雙鏈shDNA，分別與線性化的pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒4 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，過夜挑取單菌落至培養(yǎng)管，搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行質(zhì)粒提取后獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒利用BamH Ⅰ進(jìn)行單酶切鑒定后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 重組質(zhì)粒酶切鑒定

重組質(zhì)粒酶切體系為：10×buffer H 1 μL，BamH Ⅰ酶0.5 μL，BSA（10 g/L）0.25 μL，質(zhì)粒4 μL，滅菌超純水補(bǔ)至10 μL。離心混勻后，置37 ℃水浴2 h；65 ℃經(jīng)10 min滅活內(nèi)切酶，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采取和田羊耳部組織塊，使用PBS溶液（含有50萬單位青霉素-鏈霉素）清洗，之后用75%酒精浸泡2 min，再次使用PBS溶液仔細(xì)清洗。在超凈工作臺中將組織塊表皮去除，在PBS溶液中將組織塊剪碎至糊狀，使用PBS溶液離心清洗3～5遍，胰酶消化后再次使用PBS溶液離心清洗3～5遍，將清洗后的組織塊種至60 mm培養(yǎng)皿中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中放置5 min，待組織塊貼壁后取出，在培養(yǎng)皿中添加含有10% FBS的DMEM/DF12完全培養(yǎng)基（含有20萬單位青霉素-鏈霉素），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后更換培養(yǎng)基，4 d后可見耳部組織塊周圍遷移出成纖維細(xì)胞，2 d更換一次培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)量可用。利用電刺激轉(zhuǎn)染的方式將5種RNA干擾載體轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞，24 h后觀察綠色熒光蛋白GFP6表達(dá)情況。

1.6 RT-PCR檢測FGF5 mRNA表達(dá)水平

電轉(zhuǎn)染24 h后，使用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA通過RT-PCR檢測細(xì)胞樣品中FGF5基因表達(dá)量，重復(fù)3次。定量引物序列為：AAGACTGGGCGGGAGTGGTA；GGCTTGACGGGATTAGGTG。采用2-ΔΔCt法計(jì)算FGF5基因的相對表達(dá)量。

1.7 WB檢測FGF5蛋白表達(dá)水平

電轉(zhuǎn)染36 h后，棄掉培養(yǎng)液，使用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度并計(jì)算出SDS-PAGE電泳上樣量，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，之后用5%脫脂奶粉室溫?fù)u床孵育，封閉1 h。剪取一次性塑料手套指頭部分，將膜放入其中，將稀釋好的一抗滴到膜上，使用封口機(jī)封口，4 ℃過夜孵育。TBST洗膜2次，向50 mL離心管中加入稀釋過的二抗，將膜放入其中，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜2次。使用HRP-ECL發(fā)光法進(jìn)行鑒定，確定FGF5蛋白表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞中FGF5基因表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 和田羊FGF5基因shRNA干擾載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

將合成的5條寡聚核苷酸片段與pGPU6/GFP/Neo載體連接，轉(zhuǎn)化、挑菌、搖菌、質(zhì)粒提取，獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒利用BamH Ⅰ進(jìn)行單酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重組質(zhì)粒pGPU6-shRNA BamH Ⅰ單酶切鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pGPU6-shRNA BamH I單酶切鑒定Fig.1 Gel electrophoresis of recombinant interference vector with single enzyme digestion

由圖1可知，BamH Ⅰ單酶切后5個重組質(zhì)粒均只出現(xiàn)1條條帶，且大小符合預(yù)期。將提取的質(zhì)粒送公司測序，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列相符，表明4個干擾表達(dá)載體均構(gòu)建成功，pGPU6-shRNA載體圖譜見圖2。

圖2 pGPU6-shRNA載體圖譜Fig.2 PGPU6-shRNA vector map

將5個pGPU6-shRNA的載體分別命名為pGPU6-shRNA-FGF1（即PR-FGF1）、pGPU6-shRNA-FGF2（即PR-FGF2）、pGPU6-shRNA-FGF3（即PR-FGF3）、pGPU6-shRNA-FGF4（即PR-FGF4）、pGPU6-shRNAFGF5（即PR-FGF5）。

2.2 綿羊耳部成纖維原代細(xì)胞及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞（見圖3）

圖3 綿羊耳部成纖維原代細(xì)胞及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fig.3 Sheep ear fibroblasts primary cells and plasmid transfected cells

由圖3（a）可知，培養(yǎng)2 d后組織塊周圍遷移出綿羊耳部成纖維細(xì)胞；由圖3（b）可知，組織塊培養(yǎng)培養(yǎng)4 d后成纖維細(xì)胞的細(xì)胞密度約為80%。

利用電激轉(zhuǎn)染的方式將5種RNA干擾載體轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞，24 h后通過熒光顯微鏡觀察熒光情況。

由圖3（c）、3（d）可知，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞可見綠色熒光，表明成纖維細(xì)胞中開始表達(dá)外源綠色熒光蛋白，干擾載體轉(zhuǎn)染成功。

2.3 干擾載體對FGF5基因沉默效率檢測結(jié)果

以轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒PR-FGF5的成纖維細(xì)胞為對照，采用qRT-PCR檢測成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染4個干擾載體和陰性質(zhì)粒后FGF5基因mRNA表達(dá)量，結(jié)果見圖4。

圖4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后FGF5 mRNA表達(dá)量Fig.4 Expression of FGF5 mRNA after transfection with recombinant plasmid

由圖4可知，4個shRNA干擾表達(dá)載體均能夠不同程度干擾成纖維細(xì)胞中FGF5 mRNA的表達(dá)。PR-FGF1組、PR-FGF2組、PR-FGF3組、PR-FGF4組干擾效率分別為23.91%、58.85%、85.20%、43.59%，均顯著低于PR-FGF5組（P＜0.05），其中重組質(zhì)粒PR-FGF3對FGF5基因的干擾效率最高。

以轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒PR-FGF5的成纖維細(xì)胞為對照，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用WB檢測成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染4個干擾載體和陰性質(zhì)粒后FGF5蛋白表達(dá)量，結(jié)果見圖5。

圖5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后FGF5蛋白表達(dá)量Fig.5 Expression level of FGF5 protein after transfection with recombinant plasmid

由圖5可知，與PR-FGF5組相比，PR-FGF1組、PRFGF2組、PR-FGF3組、PR-FGF4組中FGF5蛋白表達(dá)量均明顯降低。其中，PR-FGF3組中FGF5蛋白表達(dá)量降低最顯著，WB結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果趨勢相同。

結(jié)果表明，PR-FGF3 RNA干擾片段抑制FGF5基因表達(dá)效果最佳。

3 討論

成纖維細(xì)胞生長因子（FGFs）屬于多肽類生長因子，通過與酪氨酸激酶型FGF受體（FGFRs）結(jié)合發(fā)揮作用[12]。目前在單細(xì)胞動物中并未發(fā)現(xiàn)FGFs基因，已發(fā)現(xiàn)的FGFs與FGFR基因全部存在于多細(xì)胞動物中。線蟲中存在兩種FGFs，人和小鼠中存在23種FGFs，因此，F(xiàn)GFs基因種類可能隨著生物的進(jìn)化不斷增多，并構(gòu)成越來越復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與更多的生物學(xué)功能。據(jù)此，深入研究FGFs及其受體FGFRs基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將為研究動物生長、生理調(diào)控過程和演化中生物功能的變化奠定基礎(chǔ)。

FGF5是FGFs家族的一員，廣泛存在于多種哺乳動物中。但有研究發(fā)現(xiàn)，不同動物中FGF5蛋白存在明顯的區(qū)別，目前，F(xiàn)GF5在人和小鼠體內(nèi)的主要作用是調(diào)控毛囊生長，是已知最有效的誘導(dǎo)毛囊從生長期轉(zhuǎn)換到休止期的因子。FGF5在毛囊生長期末期高表達(dá)，可促進(jìn)毛囊從生長期至退行期的轉(zhuǎn)換，從而抑制毛發(fā)生長[13]。采用RNAi技術(shù)或FGF5抑制劑對FGF5基因進(jìn)行抑制后，F(xiàn)GF5蛋白表達(dá)量降低，毛囊生長期被延長。

與野生型小鼠相比，通過基因打靶技術(shù)敲除FGF5基因的小鼠毛發(fā)生長速度明顯升高[14]，F(xiàn)GF5基因敲除的綿羊羊毛長度和產(chǎn)量均有所提高[15]。研究表明，F(xiàn)GF5抑制因子對人類脫發(fā)具有治療效果[16]，也可以促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長[17]。FGF5能夠改變真皮乳頭細(xì)胞的活性，抑制真皮乳頭細(xì)胞介導(dǎo)的外跟梢細(xì)胞的增殖，進(jìn)而調(diào)控毛囊周期，抑制毛發(fā)生長，誘導(dǎo)毛發(fā)再生[18]。研究發(fā)現(xiàn)，將綿羊的FGF5敲除后，F(xiàn)GFR1、雄激素、Wnt/β-catenin、Shh/Gli2、c-MYC等因子產(chǎn)生了變化并存在一些相互作用[19]。有研究表明，F(xiàn)GF5可影響綿羊毛囊發(fā)育與毛發(fā)生長[20]。綜上所述，在生物、細(xì)胞、分子水平上繼續(xù)深入研究FGF5對毛發(fā)發(fā)育的影響具有重要的意義和較高的可行性。

本研究通過RNAi技術(shù)構(gòu)建并篩選出了干擾效率達(dá)到85.2%的和田羊成纖維細(xì)胞FGF5基因干擾載體，可作為后續(xù)和田羊FGF5的RNAi序列，為研究FGF5對和田羊羊毛生長的調(diào)控、改善和田羊羊毛質(zhì)量提供技術(shù)支持。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步在其他毛囊相關(guān)細(xì)胞中進(jìn)行FGF5敲除試驗(yàn)，以探究FGF5在毛囊周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用；同時(shí)可將FGF5基因干擾與FGF5抑制劑進(jìn)行對比，探究FGF5抑制劑應(yīng)用于和田羊毛生產(chǎn)的可能性。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建并篩選出了和田羊FGF5基因的干擾表達(dá)載體，經(jīng)細(xì)胞驗(yàn)證可高效干擾和田羊FGF5基因的表達(dá)，可應(yīng)用于和田羊FGF5基因功能的研究中。