蘇杭，譚港，高珩邵，劉子湲，趙倩，吳玉，蘇金全，王紹卿*

（ 1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201 ；2.劍川縣老君山青花雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司，云南 大理 671000 ）

滇西地區(qū)山多平地少，規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)如何處理大量畜禽糞便成為亟待解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)做法是將大量新鮮糞便直接在平地晾曬之后裝袋販賣，這一做法不但浪費(fèi)土地資源，也成了春夏季節(jié)蒼蠅蚊蟲(chóng)的重要來(lái)源，不僅影響?zhàn)B殖場(chǎng)環(huán)境，且極易造成疾病傳播。將畜禽糞便進(jìn)行生物熱堆肥是解決處理大量畜禽糞便問(wèn)題的根本途徑。具體做法是在原有微生物的基礎(chǔ)上加入活性強(qiáng)、繁殖速度快的微生物，有利于加快堆肥進(jìn)程，同時(shí)將原本糞便中不易利用的粗蛋白轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，從而被其他生物利用。將畜禽糞便進(jìn)行無(wú)害化處理后的可再生利用，不但可最大化利用土地資源，還能夠保氮除臭，減少病原微生物，作為飼料、肥料應(yīng)用均具有很好的經(jīng)濟(jì)效益。青花雞作為滇西地區(qū)大理州劍川縣獨(dú)有品種，僅分布于云南少數(shù)民族聚集地，具有體格適中、肉質(zhì)風(fēng)味好、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好、外觀獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)選用市售微生物菌劑產(chǎn)品，在青花雞雛雞糞添加3%、4%、5%等3個(gè)梯度的菌液進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并檢測(cè)不同梯度樣品的發(fā)酵效果，以期為滇西特色畜禽品種青花雞糞的可再生利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雞糞收集自劍川縣老君山青花雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司的非用藥期籠養(yǎng)雛雞（0～21日齡），經(jīng)過(guò)曬干粉碎處理，共30 kg。雛雞根據(jù)《雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（1986）及參照美國(guó)NRC飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制日糧，按常規(guī)方法進(jìn)行免疫接種，自由采食和飲水。

試驗(yàn)菌液選擇市售產(chǎn)品“給它”EM菌液（由佛山市南海禪泰動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），主要成分包括枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線菌、酵母菌、酶等。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒離心柱型（北京天根生化科技有限公司），DNA Marker、Biosharp BL631A 2×Taq PCR MasterMix for PAGE（含染料）、Biosharp BS081-100g瓊脂糖Agarose、TSINGKE TSMD011 LB Lennox培養(yǎng)基干粉、1×TAE速溶顆粒（北京擎科生物科技有限公司），沙門(mén)氏菌、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS培養(yǎng)基）、麥康凱瓊脂（杭州百思生物技術(shù)有限公司）。

主要儀器：SKD-1000全自動(dòng)凱氏定氮儀（上海沛歐分析儀器有限公司）、PHS-3C pH計(jì)（上海儀電可約儀器股份有限公司）、SHA-B恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司）、JK9830自動(dòng)凱氏定氮儀（濟(jì)南精密科學(xué)儀器儀表有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、JJ-CJJ-1FD潔凈工作臺(tái)（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）、迷你高速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）、LBI-80生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）、T100梯度PCR儀（Bio-Rad Laboratories）、ZD-85恒溫振蕩箱（常州智博瑞儀器制造有限公司）、手提式高壓蒸汽滅菌鍋（上海力辰儀器科技有限公司）、1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1）

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design 單位：kg

設(shè)置1個(gè)對(duì)照組（A組）和3個(gè)試驗(yàn)組（經(jīng)處理后的雞糞中分別加入3%、4%、5%菌液，即B組、C組、D組），每組兩個(gè)重復(fù)，共8份樣品，每份樣品為3 kg雞糞。將處理好的雞糞與菌種攪拌、混勻，加水至用手握雞糞成團(tuán)，松手即散為止（預(yù)試驗(yàn)測(cè)得水分含量為40%）。各組分別裝入塑料容器，裝滿壓實(shí)，排去空氣后覆蓋塑料薄膜，蓋上蓋子密封。試驗(yàn)期90 d[1]。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 感官鑒定

發(fā)酵后檢測(cè)雞糞飼料的顏色、氣味和質(zhì)地，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[2-3]。

1.4.2 理化鑒定

采用水分測(cè)定法（GB/T 6435—2014）測(cè)定發(fā)酵后樣品水分含量，凱氏定氮法（GB/T 6432—2018）測(cè)定粗蛋白含量。采用精密pH計(jì)測(cè)定pH值，溫度計(jì)測(cè)定樣品溫度。

1.4.3 病原微生物

1.4.3.1 細(xì)菌鑒定

（1）細(xì)菌培養(yǎng)與菌落形態(tài)觀察。

發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)取1 g糞便和9 g生理鹽水混勻，制成濃度為10-1的菌液，從中取出1 g稀釋10倍，制成濃度為10-2的菌液，以此類推，最終制成濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4的樣品菌液。取200 μL懸液均勻涂布到已凝固的麥康凱、SS培養(yǎng)基上，將接種好的培養(yǎng)基置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。觀察菌落形態(tài)，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》篩選麥康凱、SS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)菌落形態(tài)是否與大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌特征相符。

（2）分子生物學(xué)鑒定。

選取上一步驟中篩選出的6份可疑菌落接種于1.5 mL LB液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)7 h。參照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒離心柱型說(shuō)明書(shū)提取DNA，選用通用引物16S rDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表2。

表2 通用引物序列Tab.2 Universal primer sequence

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板1 μL、引物上下游各0.5 μL、水10.5 μL、Mix 12.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34次循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃降溫。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI BLAST上進(jìn)行同源性分析。

（3）菌落計(jì)數(shù)。

根據(jù)前兩個(gè)步驟的結(jié)果，以麥康凱、SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的紅色菌落作為大腸桿菌（Escherichia coli）計(jì)數(shù)，檢測(cè)大腸桿菌菌落數(shù)量[4]；麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的無(wú)色菌落、SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的無(wú)色或中心為黑色的菌落作為沙門(mén)氏菌（Salmonella）計(jì)數(shù)，檢測(cè)沙門(mén)氏菌菌落數(shù)量[5]；SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的無(wú)色半透明小菌落作為志賀氏菌（Shigella）計(jì)數(shù)，檢測(cè)志賀氏菌菌落數(shù)量[6]。

1.4.3.2 寄生蟲(chóng)鑒定

參照飽和食鹽水漂浮法鑒定糞便樣品中是否存在雞蛔蟲(chóng)蟲(chóng)卵與雞球蟲(chóng)蟲(chóng)卵。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS 23軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法、鄧尼特T3法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)表3）

表3 感官測(cè)定結(jié)果Tab.3 Sensory test results

由表3可知，D組樣品發(fā)酵程度最高，發(fā)酵完成時(shí)具有較濃酸香味且略帶酒香味、質(zhì)地柔軟蓬松且呈較深棕黑色；B組、C組發(fā)酵完成時(shí)均具有較淡酸香味、質(zhì)地柔軟松散且呈棕黑色；A組仍有糞臭味、干燥結(jié)塊且呈棕灰色，即表明未發(fā)酵。

2.2 理化鑒定結(jié)果（見(jiàn)表4）

表4 理化鑒定結(jié)果Tab.4 Physical and chemical identification results

由表4可知，B組、C組發(fā)酵完成后水分含量顯著高于A組（P＜0.05），D組發(fā)酵完成后水分含量極顯著高于A組（P＜0.01）；D組發(fā)酵完成后溫度極顯著高于A組（P＜0.01）；B組、D組發(fā)酵完成后pH值極顯著高于A組（P＜0.01），C組顯著高于A組（P＜0.05）；各組發(fā)酵完成后粗蛋白含量差異均不顯著（P＞0.05）。理化鑒定結(jié)果顯示，B組、C組、D組樣品均達(dá)到發(fā)酵完成標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 病原微生物檢測(cè)

2.3.1 菌種鑒定

選擇6份符合大腸桿菌、志賀氏菌、沙門(mén)氏菌菌落形態(tài)的可疑菌株（見(jiàn)圖1）進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 可疑菌落形態(tài)Fig.1 Suspicious colony morphology

圖2 可疑菌落電泳結(jié)果Fig.2 Suspicious colony electrophoresis results

由圖2可知，6份可疑菌株經(jīng)PCR電泳均得到1 540 bp的條帶，結(jié)果符合預(yù)期。

將回收產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI BLAST上進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，1號(hào)樣品與志賀氏菌同源性達(dá)98.33%，2號(hào)樣品與大腸桿菌同源性達(dá)99.29%，3號(hào)樣品與大腸桿菌同源性達(dá)99.03%，4號(hào)樣品與海氏腸球菌同源性達(dá)94.48%，5號(hào)樣品與大腸桿菌同源性達(dá)99.39%，6號(hào)樣品與大腸桿菌同源性達(dá)99.04%。根據(jù)PCR電泳結(jié)果，參考符合志賀氏菌菌落形態(tài)和符合大腸桿菌菌落形態(tài)（見(jiàn)圖3），采用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)樣本中符合大腸桿菌、志賀氏菌菌落形態(tài)的菌落數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表5。

圖3 符合描述的大腸桿菌與志賀氏菌菌落形態(tài)Fig.3 Morphology of Escherichia coli and Shigella according to the description

表5 樣品發(fā)酵后菌落數(shù)量Tab.5 Statistical table of colony number 單位：個(gè)/mL

由表5可知，D組樣品中大腸桿菌數(shù)量比A組下降了4個(gè)數(shù)量級(jí)，C組、D組樣品均未培養(yǎng)出志賀氏菌。綜上所述，D組的發(fā)酵效果最好。

2.3.2 寄生蟲(chóng)鑒定結(jié)果（見(jiàn)圖4）

圖4 寄生蟲(chóng)鑒定結(jié)果Fig.4 Parasitic identification result

由圖4可知，各組樣品鏡檢寄生蟲(chóng)結(jié)果均為陰性。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，不同梯度的微生物菌劑均能夠促進(jìn)雞糞發(fā)酵過(guò)程，D組發(fā)酵效果最好，該梯度樣品發(fā)酵完成后帶有酸香味、酒香味，質(zhì)地松軟均勻，顏色為較深的棕黑色，水分增多，溫度升高，pH值處于5.5～8.5，這與李尚民等[7]的研究結(jié)果相同。本試驗(yàn)中樣品發(fā)酵完成后的溫度低于李尚民等[7]、張玉鳳等[8]試驗(yàn)溫度，原因可能是本研究中的發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)值冬春交替，且位于高海拔山區(qū)，故發(fā)酵完成時(shí)溫度較低，所需時(shí)間也較長(zhǎng)。因此，可根據(jù)畜禽糞便堆肥過(guò)程中不同溫度下的優(yōu)勢(shì)菌種，選擇適用于滇西片區(qū)畜禽糞便發(fā)酵的微生物。如Jiang等[9]分離出的一種適用于中國(guó)寒冷地區(qū)畜禽糞便高效性低溫發(fā)酵的嗜冷真菌，不但能夠快速降解纖維素也可用于低溫發(fā)酵，極其適用于高海拔山區(qū)的畜禽糞便發(fā)酵。何凌[10]研究發(fā)現(xiàn)，以1∶1∶1比例混合米曲霉、釀酒酵母、白地霉混合發(fā)酵鴨糞產(chǎn)生菌體蛋白的產(chǎn)量最高，這一研究結(jié)果提示可將發(fā)酵畜禽糞便作為有機(jī)肥料，促進(jìn)畜禽糞便的可再生利用。

本試驗(yàn)中，發(fā)酵完成后，D組樣品中的大腸桿菌數(shù)相比A組下降了63.59%～76.82%，且未檢出志賀氏菌，這與劉小飛[2]、張玉鳳等[8]的結(jié)果相同。原因可能是本試驗(yàn)選擇的青花雞養(yǎng)殖場(chǎng)未流行傷寒、副傷寒等禽沙門(mén)氏菌病[11]，但部分雛雞出現(xiàn)輕微腹瀉，存在選取的6份可疑菌落未包含沙門(mén)氏菌的可能。本研究中，分離自A組樣品的1號(hào)可疑菌株可能為福氏或宋內(nèi)氏志賀氏菌。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，樣本來(lái)源的部分7～14日齡雛雞發(fā)生不嚴(yán)重的腹瀉[12]。因此，后續(xù)可進(jìn)一步開(kāi)展試驗(yàn)，重新對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)采樣并設(shè)計(jì)特異性引物，結(jié)合生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等方法[13]分離鑒定分離自青花雞糞的雞源性志賀氏菌，對(duì)滇西片區(qū)云南地方雞種志賀氏菌病防治具有重要意義。

養(yǎng)殖過(guò)程中結(jié)合臨床癥狀發(fā)現(xiàn)，有個(gè)別青花雞出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、咳嗽、啰音、腹瀉、產(chǎn)軟殼蛋等禽大腸桿菌病癥狀[14]，但也可能為多種病原體混合感染或營(yíng)養(yǎng)代謝病等，可采用黃芩散、芩柏龍膽散、抗生素等進(jìn)行防治[15]。近年來(lái)，臨床常采用噬菌體治療禽大腸桿菌病及沙門(mén)氏菌，Pantoja-Don等[16]、Kittler等[17]研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體可改善腸道菌群，減少疾病發(fā)生并提高機(jī)體免疫力。Maslov等[18]的噬菌體“殺死勝利者假說(shuō)”也促進(jìn)了噬菌體應(yīng)用于畜禽糞便發(fā)酵過(guò)程的相關(guān)研究。本研究中，各組樣品鏡檢均未檢出雞球蟲(chóng)、雞蛔蟲(chóng)的蟲(chóng)卵，原因可能是發(fā)酵前青花雞雛雞糞經(jīng)曬干粉碎處理導(dǎo)致蟲(chóng)卵死亡，且試驗(yàn)所選為籠養(yǎng)雛雞，糞便中無(wú)雞蛔蟲(chóng)、雞球蟲(chóng)感染。但結(jié)合臨床癥狀及病理剖檢結(jié)果可知，個(gè)別散養(yǎng)青花雞腸道內(nèi)存在寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體，應(yīng)進(jìn)一步確定蟲(chóng)種再進(jìn)行治療。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，使用EM菌劑發(fā)酵雞糞時(shí)，應(yīng)選擇添加量至少為5%的菌液進(jìn)行發(fā)酵,并根據(jù)滇西片區(qū)氣候特點(diǎn)選擇適合畜禽糞便發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)微生物。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步測(cè)定雞糞發(fā)酵前后真蛋白（菌體蛋白）含量，并對(duì)青花雞腸道志賀氏菌群的具體感染情況及分型、沙門(mén)氏菌群和其他腸道致病菌群感染情況及耐藥性分析開(kāi)展進(jìn)一步研究。