張 虎 馮 巧 朱展鵬 戴海燕 段迎春 胡 花

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率居中國女性惡性腫瘤的第6位，居生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位，在美國、歐洲及中國部分發(fā)達(dá)地區(qū)居首位[1]。近年來，子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)病率及相關(guān)死亡率均增高，我國子宮內(nèi)膜樣癌約占所有子宮內(nèi)膜癌病例的70%，導(dǎo)致其醫(yī)療負(fù)擔(dān)明顯加重。與西方國家相比，中國子宮內(nèi)膜樣癌患者的5年生存率相對(duì)較低(中國為55.1%，美國為85.0%)[2]。因此，針對(duì)子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其影響因素的研究刻不容緩。僅從基因和環(huán)境因素尚不能完全闡明子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制。陰道菌群已被證實(shí)與卵巢癌、宮頸癌、胃腸道腫瘤等的發(fā)生相關(guān)。也有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，陰道阿托波菌和卟啉單胞菌與子宮內(nèi)膜癌(包括子宮內(nèi)膜樣癌、黏液性癌、漿液性癌、鱗狀細(xì)胞癌和癌肉瘤)的發(fā)生具有較顯著的相關(guān)性。目前尚缺乏不同病理類型子宮內(nèi)膜癌患者陰道菌群特征及可能作用機(jī)制的研究。本研究旨在分析子宮內(nèi)膜樣癌患者陰道菌群的特點(diǎn)，預(yù)測其可能參與子宮內(nèi)膜樣癌發(fā)生、發(fā)展的功能通路，為子宮內(nèi)膜樣癌無創(chuàng)篩查及發(fā)病機(jī)制研究提供新的角度。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 采用回顧性病例對(duì)照研究方法，收集2017年9月—2020年12月就診于上海市浦東醫(yī)院婦產(chǎn)科的35例超聲檢查提示子宮內(nèi)膜異常增厚的患者臨床資料及陰道分泌物標(biāo)本，所有患者均通過診斷性刮宮或?qū)m腔鏡手術(shù)獲取病理組織，由2位資深的病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片并做出診斷，診斷結(jié)果一致，診斷為子宮內(nèi)膜樣癌或增殖期子宮內(nèi)膜?；颊叩哪挲g為(51.63±8.69)歲，BMI為(25.44±4.24) kg/m2。將病理提示子宮內(nèi)膜樣癌的16例患者設(shè)為內(nèi)膜樣癌組，按2018年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期，其中ⅠA期9例， ⅠB期2例，Ⅱ期2例，ⅢA、ⅢB及ⅢC1期各1例。將19例病理提示增殖期子宮內(nèi)膜者設(shè)為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為30～80歲子宮內(nèi)膜樣癌患者或異常子宮內(nèi)膜增厚患者(絕經(jīng)患者內(nèi)膜增厚>5 mm，非絕經(jīng)患者月經(jīng)干凈3 d后內(nèi)膜厚度>10 mm)；②30 d內(nèi)無局部或全身使用抗生素，7 d內(nèi)無陰道給藥及陰道沖洗；③生殖系統(tǒng)發(fā)育正常，無畸形，無生殖系統(tǒng)贅生物；④48 h內(nèi)無性生活。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期或哺乳期；②陰道炎癥性疾病(外陰陰道假絲酵母菌病、滴蟲性陰道炎等)；③6個(gè)月內(nèi)有雌激素或雌激素類藥物使用史、使用宮內(nèi)節(jié)育器；④卵巢腫瘤、子宮肌瘤、宮頸良惡性疾病及其他惡性腫瘤；⑤自身免疫性疾??；⑥30 d內(nèi)有泌尿生殖道手術(shù)史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為QWJWXKJS.08)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 陰道取樣 在初次就診時(shí)，詢問患者病史并進(jìn)行婦科檢查，獲取相關(guān)臨床信息，明確是否符合納入或排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所有納入患者進(jìn)行后續(xù)隨訪。入選當(dāng)日對(duì)患者進(jìn)行陰道樣本取樣，為避免樣本污染，陰道擴(kuò)張器以無菌0.9%氯化鈉溶液潤滑，擴(kuò)張暴露宮頸后，用無菌棉簽取陰道后穹隆部的分泌物，旋轉(zhuǎn)擦拭10～15 s，采集后將陰道拭子立即放入無菌試管中，每例患者平行采集3份，編號(hào)后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 陰道微生物16S核糖體RNA(16S-rRNA)測序 ①細(xì)菌總DNA提?。菏占颊邇龃娴年幍朗米訕?biāo)本，根據(jù)FastDNATMSPIN Kit for Soil試劑盒說明書進(jìn)行總DNA抽提。②PCR擴(kuò)增：采用PCR擴(kuò)增法獲得特異性目的基因片段，使用338F(5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)和806R(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)引物對(duì)V3至V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(應(yīng)用TransGen AP221-02：TransStartR FastPfu DNA Polymerase試劑盒，20 μL反應(yīng)體系；PCR儀為ABI GeneAmp○R9700型)，使用AxyPrep DNA Gel Extraction試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。應(yīng)用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測，PCR擴(kuò)增DNA濃度<0.2 g/L(濃度評(píng)級(jí)為C級(jí))的樣本予以剔除。③Illumina Miseq文庫構(gòu)建及測序：定量檢測后按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端；使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物；以Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，應(yīng)用TruSeqTMDNA Sample Prep試劑盒進(jìn)行文庫制備，于Illumina MiseqPE300平臺(tái)(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)進(jìn)行測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 將測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)應(yīng)用Trimmomatic軟件對(duì)序列質(zhì)控，F(xiàn)lash軟件進(jìn)行拼接,區(qū)分樣本后應(yīng)用UPARSE軟件進(jìn)行操作分類單元(OTU)分析；應(yīng)用RDP classifier 2.11和Uparse 7.0.1090分析軟件，分別對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析和聚類分析，應(yīng)用Qiime 1.9.1軟件生成各分類學(xué)水平豐度表，多樣性距離計(jì)算，Mothur1.30.2軟件進(jìn)行多樣性分析，PICRUSt1.1.0軟件用于16S序列的蛋白質(zhì)直系同源簇信息(clusters of orthologous groups of proteins，COG)功能預(yù)測。

1.2.4 陰道微生物組學(xué)差異性分析 進(jìn)行陰道微生物α多樣性分析、β多樣性分析，以及微生物的功能預(yù)測分析。微生物α多樣性主要反映組內(nèi)微生物種類的多樣性和豐富度，指標(biāo)包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Coverage指數(shù)。β多樣性主要反映組間微生物組成的差異，采用非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析，NMDS分析的距離算法采用Bray_Curtis，組間差異采用ANOSIM分析。微生物的功能預(yù)測分析通過PICRUSt 1.1.0軟件基于高通量測序結(jié)果與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，尋找組間差異富集的功能通路。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組患者的一般資料，包括年齡(<52歲、≥52歲)，BMI(<25.44 kg/m2、≥25.44 kg/m2)，是否絕經(jīng)，有無高血壓、糖尿病病史，分娩次數(shù)(1、2、>2次)，流產(chǎn)次數(shù)(0、1、>1次)，性生活頻率(<4次/月、≥4次/月)。記錄并比較兩組陰道微生物α多樣性分析結(jié)果、群落組成情況、β多樣性分析結(jié)果，以及陰道微生物的功能預(yù)測分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的一般資料比較 兩組間患者的年齡、BMI，絕經(jīng)、高血壓、糖尿病人數(shù)，以及分娩次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、性生活頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料的比較 (n)

2.2 兩組陰道微生物α多樣性分析結(jié)果比較 兩組間Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Coverage指數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

表2 兩組陰道微生物α多樣性分析結(jié)果的比較

2.3 兩組陰道微生物群落組成情況比較 本研究列出了在菌屬豐度排名前23位的微生物，兩組中相對(duì)豐度最高的細(xì)菌均為乳酸桿菌屬。內(nèi)膜樣癌組菌屬相對(duì)豐度居前10位由高至低依次為乳酸桿菌屬(31.16%)，普氏菌屬(16.60%)，厭氧菌屬(6.03%)，鏈球菌屬(4.77%)，解脲支原體(3.62%)，加德納菌屬(3.32%)，嗜胨菌屬(2.90%)，消化鏈球菌屬(1.90%)，卟琳單胞菌屬(1.86%)，不動(dòng)桿菌屬(1.86%)。對(duì)照組菌屬相對(duì)豐度居前10位由高至低依次為乳酸桿菌屬(15.80%)，加德納菌屬(15.39%)，普氏菌屬(11.8%)，奇異菌屬(9.15%)，厭氧菌屬(7.33%)，韋榮球菌屬(4.22%)，腸球菌屬(3.54%)，纖毛菌屬(2.64%)，芬格爾德菌屬(1.93%)，卟琳單胞菌屬(1.78%)。見圖1。內(nèi)膜樣癌組加德納菌屬相對(duì)豐度(3.32%)顯著低于對(duì)照組(15.39%，P=0.03)，兩組間其余菌屬相對(duì)豐度的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

圖1 兩組陰道微生物群落組成情況

2.4 兩組陰道微生物β多樣性分析結(jié)果比較 NMDS分析結(jié)果顯示，內(nèi)膜樣癌組與對(duì)照組樣本空間分布比較接近，重合度高，表明兩樣本物種組成相似，提示兩組間β多樣性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.32)，且Stress(觀察到的距離與擬合的距離不一致性)=0.19，故此分析可靠。見圖2。

圖2 NMDS分析圖

2.5 兩組陰道微生物的功能預(yù)測分析 通過PICRUSt1.1.0軟件基于高通量測序結(jié)果與COG數(shù)據(jù)庫比對(duì)的結(jié)果顯示，內(nèi)膜樣癌組次生代謝物生物合成運(yùn)輸與分解代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的功能豐度值分別為190 899.88±11 187.84、136 818.06±11 248.72，均顯著高于對(duì)照組的115 730.86±3 542.88、47 544.90±2 647.83(P值均<0.01)。

3 討 論

本研究通過16S-rRNA測序及生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，內(nèi)膜樣癌組加德納菌屬相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組，次生代謝物生物合成運(yùn)輸與分解代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的功能豐度值均顯著高于對(duì)照組，揭示了子宮內(nèi)膜樣癌患者陰道菌群組成特點(diǎn)，即陰道加德納菌屬相對(duì)豐度顯著降低，次生代謝生物合成運(yùn)輸與分解代謝系統(tǒng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的功能顯著增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，兩組間Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Coverage指數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組間患者陰道菌群多樣性和豐富度基本一致。

子宮內(nèi)膜樣癌患者陰道菌群主要為乳酸桿菌屬、普氏菌屬及厭氧球菌屬。雖然陰道乳酸桿菌仍為優(yōu)勢(shì)菌，但其相對(duì)豐度<40%，其他菌群相對(duì)豐度則相應(yīng)增高。本研究納入的患者多處于圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)期，不同于育齡期婦女的陰道微生物特點(diǎn)；大多研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期人群乳酸桿菌相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，部分患者乳酸桿菌屬不再是優(yōu)勢(shì)菌群，而加德納菌屬、普氏菌屬和奇異菌屬等相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。另有研究[9]結(jié)果顯示，絕經(jīng)后正常婦女陰道乳酸桿菌屬并未顯著減少或消失，考慮該結(jié)果與上述研究結(jié)果不同的原因?yàn)榧{入研究對(duì)象存在差異。子宮內(nèi)膜樣癌患者和增殖期子宮內(nèi)膜者臨床上常表現(xiàn)為異常子宮出血，既往研究[10]也發(fā)現(xiàn)異常子宮出血的患者陰道普氏菌屬相對(duì)豐度增高，與本研究發(fā)現(xiàn)相似。本研究中仍有較多菌群未能明確，提示16S-rRNA測序法雖可檢測出已知的大部分菌群，但方法仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜樣癌患者陰道加德納菌屬相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著下降，表明陰道加德納菌可能與子宮內(nèi)膜樣癌相關(guān)。加德納菌屬是陰道常見共生菌群之一，可分泌唾液酸酶。有研究[11]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的唾液酸酶包含4種類型，分別為神經(jīng)氨酸酶(NEU)1、NEU2、NEU3和NEU4，在多種腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。但4種唾液酸酶在子宮內(nèi)膜樣癌中起作用的亞型及調(diào)控機(jī)制尚未被闡明。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)膜樣癌組加德納菌屬相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組，推測唾液酸酶含量也隨之降低，在4種類型神經(jīng)氨酸酶的相互作用下導(dǎo)致體內(nèi)唾液酸酶異常，從而參與子宮內(nèi)膜發(fā)生癌變。加德納菌產(chǎn)生的細(xì)菌毒素和代謝產(chǎn)物也可能參與宿主表觀遺傳染色質(zhì)重塑，下調(diào)或上調(diào)與正常細(xì)胞周期和腫瘤抑制有關(guān)的關(guān)鍵基因產(chǎn)物，但目前均缺乏其在子宮內(nèi)膜癌中的研究。Walther-António等[4]研究發(fā)現(xiàn)，陰道阿托波菌和卟啉單胞菌與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生相關(guān)，但本研究結(jié)果未顯示內(nèi)膜樣癌組與對(duì)照組陰道卟啉單胞菌屬相對(duì)豐度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能受內(nèi)膜癌的病理類型、人種、腫瘤分期不同等影響。陰道加德納菌屬相對(duì)豐度的改變可能為子宮內(nèi)膜樣癌的陰道微生物表現(xiàn)之一。子宮內(nèi)膜樣癌是雌激素依賴型，在無孕激素拮抗的雌激素長期作用下發(fā)生。圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后婦女由于雌激素水平下降，導(dǎo)致陰道加德納菌屬相對(duì)豐度增高，但子宮內(nèi)膜樣癌患者體內(nèi)無孕激素拮抗的雌激素刺激可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜樣癌患者的陰道乳酸桿菌屬相對(duì)豐度增高，進(jìn)而使陰道加德納菌屬相對(duì)豐度下降[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，內(nèi)膜樣癌組次生代謝物生物合成運(yùn)輸與分解代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的功能豐度值均顯著高于對(duì)照組。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的獲得是腫瘤細(xì)胞具有侵襲表型的一個(gè)關(guān)鍵特性，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)可通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Rho鳥苷三磷酸酶(Rho GTPase)等通路進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲對(duì)ERK信號(hào)的需求可能取決于相關(guān)基因改變[14]。微生物次生代謝物生物合成運(yùn)輸與分解代謝產(chǎn)物包括有毒的代謝物，這些代謝物的循環(huán)可能在遠(yuǎn)離特定微生物的地方導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。已有研究[3]證實(shí)，微生物代謝產(chǎn)物與胃腸道腫瘤、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌等腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。由于細(xì)菌種類多且復(fù)雜，鑒定導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的微生物或細(xì)菌產(chǎn)物仍具有挑戰(zhàn)性，破譯特定細(xì)菌產(chǎn)物在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用仍處于初級(jí)階段。

綜上所述，子宮內(nèi)膜樣癌患者陰道菌群具有特異性，其中陰道加德納菌屬相對(duì)豐度降低，為未來基于陰道菌群理論實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜樣癌無創(chuàng)篩查提供可能；子宮內(nèi)膜樣癌患者次生代謝物生物合成運(yùn)輸與分解代謝系統(tǒng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的功能顯著增強(qiáng)，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。有關(guān)子宮內(nèi)膜樣癌患者的陰道微生物群研究處于起步階段，許多關(guān)鍵問題仍有待進(jìn)一步探索，基于信息收集和描述性研究進(jìn)而構(gòu)建子宮內(nèi)膜樣癌患者陰道微生物全景圖尤為必要。