姜永紅， 陳一柳， 樊秋月， 劉旭華

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童非典型肺炎最常見的病原體，感染率隨年齡增長而增加。6歲以上兒童MP檢出率高達62%[1]。由于MP結(jié)構(gòu)的特殊性，其對β-內(nèi)酰胺類抗生素天然耐藥，對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素敏感[2]。但近些年，隨著MP耐藥率逐年上升，難治性肺炎支原體肺炎（mycoplasmapneumoniae pneumonia，MPP）發(fā)病率逐年上升，尤其在亞洲國家最為明顯[3]。難治性MPP的臨床癥狀嚴重甚至發(fā)生死亡，對患兒的生命健康造成了極大的威脅。中醫(yī)藥因具有副作用小、多靶點發(fā)揮作用的優(yōu)勢，成為治療MPP，特別是耐大環(huán)內(nèi)酯類抗生素或?qū)Υ蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素不敏感MPP的一種可靠選擇。

研究發(fā)現(xiàn)，MP感染疾病的嚴重程度與炎癥反應(yīng)相關(guān)[4]，且細胞焦亡與肺部炎癥之間有著密切的關(guān)系[2]。細胞焦亡是由炎癥小體參與的依賴炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）的一種新的細胞程序性死亡方式，主要表現(xiàn)為細胞核皺縮、細胞膜成孔，導(dǎo)致細胞腫脹破裂，細胞內(nèi)容物釋放，進而激活強烈的炎癥反應(yīng)，因此，細胞焦亡又稱為細胞的炎性壞死[5]。Caspase-1在細胞凋亡和焦亡過程中均發(fā)揮重要的作用。課題組通過前期實驗證明，清肺通絡(luò)方能夠下調(diào)由凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）、Caspase-1、Nod樣受體蛋白3（NLRP3）構(gòu)成的炎癥小體活性，減輕炎癥反應(yīng)，抑制細胞凋亡[6]。故本研究進一步以Caspase-1為切入點，通過建立人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞感染及過表達質(zhì)粒模型探討清肺通絡(luò)方對MP感染的治療作用及機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞 人正常肺上皮細胞BEAS-2B，購自上海中喬新舟生物科技有限公司（批號：ZQ0381）。

1.2 菌株與試劑 肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)菌株（MPFH，購自美國ATCC）。Caspase-1抑制劑（ZYVAD-FMK，美國MedChemExpress公司生產(chǎn)，批號：HY-P1009）；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8，美國SAB公司）；Caspase-1 FLICA分析試劑盒（德國Eterlife公司）；碘化丙啶（PI）染液（美國Invitrogen公司）；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Na+-K+-ATP酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；白細胞介素（IL）-1β檢測試劑盒、IL-18檢測試劑盒（上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司）；Caspase-1、pro-Caspase-1、消皮素D（GSDMD）、消皮素D-N端片段（GSDMD-N）等兔單克隆抗體（英國Abcam公司）；羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG二抗（碧云天生物技術(shù)有限公司）；SYBRGreen PCR試劑盒（美國Thermo公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）。

1.3 儀器 LGJ-10D冷凍干燥機（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；CytoFLEX型流式細胞儀（美國Beckman公司）；TDZ4-WS型離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；Mini-Protean 3 Cell型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；PS-9型電轉(zhuǎn)儀（大連競邁科技有限公司）；ABI-7300型Real-time PCR檢測儀（美國ABI公司）；TG-16M型低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；DNM-9602型酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；XDS-500C型顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）。

1.4 藥物及制備 清肺通絡(luò)方由桑白皮10 g、地骨皮10 g、虎杖15 g、桃仁10 g、地龍10 g、半枝蓮15 g、蘇子10 g、葶藶子10 g、甘草5 g組成。上述中藥飲片為華宇中藥上海有限責(zé)任公司產(chǎn)品。按桑白皮∶地骨皮∶虎杖∶桃仁∶地龍∶半枝蓮∶蘇子∶葶藶子∶甘草=2∶2∶3∶2∶2∶3∶2∶2∶1，將中藥材研磨粉碎后，放入容器，用10倍純水浸泡40 min，經(jīng)2次煎煮（第1次1 h，第2次30 min）過濾后，濃縮藥液至浸膏狀，用冷凍干燥機制成干粉。由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院制劑室制備。每100 g中藥飲片可提取出19.8 g中藥提取物粉末。稱取藥物提取物粉末，加少量DMSO助溶，再加入雙蒸水溶解，超聲震蕩，過濾除菌，配制為1 g/mL（生藥濃度）的中藥溶液。將配制好的中藥溶液保存在-20℃冰箱中備用。

1.5 肺炎支原體菌株擴增 每100 mL支原體肉湯培養(yǎng)基，包括支原體肉湯干粉2.04 g、葡萄糖0.5 g、雙蒸水80 mL、0.1%酚紅2 mL，混勻后于121℃高壓滅菌15 min。取支原體添加劑G（SR0059）溶于20 mL高壓滅菌處理的蒸餾水中，在冷卻至50℃時加入支原體肉湯培養(yǎng)基，將暗紅色菌液于4℃保存。使用液體培養(yǎng)法連續(xù)將菌種傳代，選擇第3代，選取顏色變化單位（color change units，CCU）測定菌液濃度。進行后續(xù)實驗時，將原始MP菌液稀釋至1×107CCU/mL。

1.6 BEAS-2B細胞模型的制備與分組 不同濃度中藥提取物對MP感染BEAS-2B細胞活力的影響：取96孔培養(yǎng)板，將BEAS-2B細胞分為空白對照組、模型對照組、清肺通絡(luò)方5個濃度組，每孔5×104個細胞。模型對照組和清肺通絡(luò)方組以1×107CCU/mL濃度MP感染BEAS-2B細胞，置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育24 h。清肺通絡(luò)方5個濃度組分別在培養(yǎng)基中滴加0.1、0.5、1、2、4 mg/L清肺通絡(luò)方溶液，培養(yǎng)24 h。按1∶10體積比混合Cell Counting Kit-8（CCK-8）和無血清必需基本培養(yǎng)基，每孔100μL加入待測孔中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度，并計算細胞存活率。確認經(jīng)不同濃度清肺通絡(luò)方干預(yù)MP感染細胞后，清肺通絡(luò)方各濃度組較模型組有一定的促進細胞增殖作用，且呈濃度依賴關(guān)系。最終篩選清肺通絡(luò)方最佳濃度為2 mg/L用于后續(xù)實驗。

繼而，將BEAS-2B細胞隨機分為4組：空白對照組（A）、模型組（B）、清肺通絡(luò)方組（C）、Caspase-1抑制劑組（D）。BEAS-2B細胞常規(guī)復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清F12K培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×109個/mL，按照每孔0.5 mL接種至96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長進入對數(shù)增殖期時，收獲培養(yǎng)細胞。模型組（B）：細胞傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，采用1×107CCU/mL濃度MP菌液進行感染。同時，設(shè)立正常培養(yǎng)的BEAS-2B細胞為空白對照組（A），于37℃、5%CO2條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h。清肺通絡(luò)方組（C）：在1×107CCU/mL濃度MP菌液感染24 h后加入2 mg/L清肺通絡(luò)方溶液培養(yǎng)24 h。Caspase-1抑制劑組（D）：在1×107CCU/mL濃度MP菌液感染前1 h加入20μmol/L Z-YVAD-FMK作為陽性對照組干預(yù)。

1.7 過表達Caspase-1質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染與分組通過NCBI網(wǎng)站查找Caspase-1（人）基因的mRNA序列，針對CDS區(qū)域以及選用載體設(shè)計引物及酶切位點。將含有酶切位點的目的基因ncRNA區(qū)域序列交予金唯智基因公司合成，將合成的質(zhì)粒送往上海美吉生物有限公司DNA測序，測序所得結(jié)果與NCBI網(wǎng)站中Caspase-1序列進行比對，比對率為100%的質(zhì)粒保留菌液。

將BEAS-2B細胞隨機分為4組：空白對照組（E）、空白質(zhì)粒組（F）、過表達質(zhì)粒組（G）、清肺通絡(luò)方2組（H）。

將狀態(tài)良好的細胞鋪于細胞培養(yǎng)板中，在細胞長至70%～80%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書上的步驟，將空載體以及Caspase-1過表達質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染6 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞。轉(zhuǎn)染空載體的為空白質(zhì)粒組（F）；轉(zhuǎn)染Caspase-1過表達質(zhì)粒的為過表達質(zhì)粒組（G）。

空白質(zhì)粒組（F）、過表達質(zhì)粒組（G）：細胞傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，分別用1×107CCU/mL濃度MP菌液進行感染，同時設(shè)立BEAS-2B細胞為空白對照組（E），于37℃、5%CO2條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h。清肺通絡(luò)方2組（H）：在1×107CCU/mL濃度MP菌液感染24 h后，加入2 mg/L清肺通絡(luò)方溶液培養(yǎng)24 h。

1.8 觀察指標(biāo)與方法

1.8.1 CCK-8法檢測12、24 h細胞增殖活性 將BEAS-2B細胞隨機分為4組，即空白對照組（A）、模型組（B）、清肺通絡(luò)方組（C）、Caspase-1抑制劑組（D）；另將BEAS-2B細胞隨機分為3組，包括空白質(zhì)粒組（F）、過表達質(zhì)粒組（G）、清肺通絡(luò)方2組（H）。細胞處理同上。用CCK-8法檢測12、24 h細胞增殖活性。操作方法：將處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，顯微鏡下計數(shù)后制成5×104個/mL的細胞懸液。分別取100μL至96孔培養(yǎng)板，設(shè)3個復(fù)孔，5×103個細胞/孔，以100μL培養(yǎng)液做空白對照，37℃培養(yǎng)過夜。按照實驗分組對細胞進行相應(yīng)處理，在0、12、24 h后，按照1∶10體積比混合CCK-8和無血清必需基本培養(yǎng)基，每孔100μL加入待測孔中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度，并計算細胞活力。

1.8.2 Western Blot法檢測細胞Caspase-1、pro-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表達 將需要抽提蛋白的細胞，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，按比例加入裂解液進行勻漿，冰上靜置30 min后，于4℃、12 000 r/min離心10 min。取上清，使用BAC法測定蛋白濃度后，置-80℃冰箱備用。將上清液（含25μg蛋白）經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（25 V，30 min）。經(jīng)50 g/L脫脂奶粉封閉后加按體積比稀釋的一抗Caspase-1（1∶1 000）、pro-Caspase-1（1∶800）、GSDMD（1∶1 000）、GSDND-N（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）工作液4℃孵育過夜，磷酸鹽-Tween-20緩沖液（PBST）洗滌后再加入按體積比1∶500稀釋的二抗，室溫孵育1 h。再經(jīng)PBST漂洗后加入化學(xué)發(fā)光液進行曝光顯影，最后應(yīng)用ImageJ軟件分析灰度值。結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。

1.8.3 ELISA法檢測細胞上清液IL-1β和IL-18水平 取BEAS-2B細胞上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行，在全自動酶標(biāo)儀上450 nm波長處測各組吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出濃度。

1.8.4 生化法檢測細胞LDH和Na+-K+-ATP酶活性 嚴格按照LDH測試盒說明書進行操作，檢測LDH活性需將待測液體混勻后，室溫放置5 min，應(yīng)用全自動酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定吸光度。檢測Na+-K+-ATP酶活性需將待測液體40℃水浴10 min，應(yīng)用全自動酶標(biāo)儀于660 nm波長處測定吸光度。根據(jù)公式計算LDH、Na+-K+-ATP酶活性。

1.8.5 流式細胞術(shù)檢測細胞焦亡 離心收集BEAS-2B細胞，制成單細胞懸液，參照Caspase-1FLICA分析試劑盒說明書，對細胞中活化的Caspase-1進行FLICA/PI雙陽性染色來評估細胞焦亡。

1.8.6 PCR法檢測細胞Caspase-1 mRNA表達 提取各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參。PCR擴增反應(yīng)程序：95℃10 min；95℃15 s，60℃45 s，40個循環(huán)。熔解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s。采用儀器自帶軟件（ABIPrism 7300 SDSSoftware）進行數(shù)據(jù)分析。Caspase-1上游引物序列為5’-TGAATTATTACAG ACAAGGGTG-3’，下游引物序列為5’-AACGGAG TCAATCAAAGC-3’，擴增片段為103 bp；GAPDH上游引物序列為5’-AATCCCATCACCATCTTC-3’，下游引物序列為5’-AGGCTGTTGTCATACTT C-3’，擴增片段為218 bp。

1.9 統(tǒng)計方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以O(shè)ne-Way ANOVA的Homogeneity-of-variance進行方差齊性檢驗，如方差齊則直接進行單因素方差分析，并用LSD進行兩兩比較；如方差不齊則用Transform中的Rank Cases進行變量變換后，再用One-Way ANOVA進行單因素方差分析，并用LSD進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清肺通絡(luò)方干預(yù)MP感染BEAS-2B細胞的實驗結(jié)果

2.1.1 清肺通絡(luò)方對MP感染BEAS-2B細胞活力的影響 圖1結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型組12、24 h細胞活力顯著下降（P＜0.001）。與模型組比較，清肺通絡(luò)方組、Caspase-1抑制劑組12、24 h細胞活力均顯著增加（P＜0.001）。

圖1 清肺通絡(luò)方（QTF）干預(yù)12、24 h對肺炎支原體（MP）感染BEAS-2B細胞活力的影響Figure 1 Effect of 12-and 24-hour intervention with Qingfei Tongluo Prescription on the viability of MP-infected BEAS-2B cells

2.1.2 清肺通絡(luò)方對MP感染BEAS-2B細胞pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表達的影響 圖2結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型組Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組比較，清肺通絡(luò)方組Caspase-1、GSDMD-N、GSDMD表達降低（P＜0.05或P＜0.01），Pro-Caspase-1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Caspase-1抑制劑組Pro-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、Caspase-1表達水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.001）。

圖2 清肺通絡(luò)方（QTF）對肺炎支原體（MP）感染BEAS-2B細胞pro-Caspase-1、Caspase-1、消皮素D（GSDMD）、消皮素D-N端片段（GSDMD-N）表達的影響Figure 2 Effect of Qingfei Tongluo Prescription on the expression of pro-Caspase-1，Caspase-1，GSDMD and GSDMD-N in MP-infected BEAS-2B cells

2.1.3 清肺通絡(luò)方對MP感染BEAS-2B細胞炎癥因子IL-1β、IL-18含量的影響 圖3結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型組IL-1β、IL-18含量均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，清肺通絡(luò)方組、Caspase-1抑制劑組IL-1β、IL-18含量均顯著降低（P＜0.001）。

圖3 清肺通絡(luò)方（QTF）對肺炎支原體（MP）感染BEAS-2B細胞炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-18含量的影響Figure 3 Effect of Qingfei Tongluo Prescription on the content of inflammatory factors IL-1βand IL-18 in MP-infected BEAS-2B cells

2.1.4 清肺通絡(luò)方對MP感染BEAS-2B細胞焦亡率的影響 圖4結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型組細胞焦亡率顯著上升（P＜0.001）；與模型組比較，清肺通絡(luò)方組、Caspase-1抑制劑組細胞焦亡率均顯著下降（P＜0.001）。

圖4 清肺通絡(luò)方（QTF）對肺炎支原體（MP）感染BEAS-2B細胞焦亡的影響Figure 4 Effect of Qingfei Tongluo Prescription on the pyroptosis of MP-infected BEAS-2B cells

2.1.5 清肺通絡(luò)方對MP感染BEAS-2B細胞LDH、Na+-K+-ATP酶活性的影響 圖5結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型組LDH活性明顯上升（P＜0.001）、Na+-K+-ATP酶活性顯著下降（P＜0.001）；與模型組比較，清肺通絡(luò)方組、Caspase-1抑制劑組LDH活性顯著下降（P＜0.001），Na+-K+-ATP酶活性明顯上升（P＜0.01或P＜0.001）。

圖5 清肺通絡(luò)方（QTF）對肺炎支原體（MP）感染BEAS-2B細胞乳酸脫氫酶（LDH）、Na+-K+-ATP酶活性的影響Figure 5 Effect of Qingfei Tongluo Prescription on LDH and Na+-K+-ATPase activities in MP-infected BEAS-2B cells

2.2 清肺通絡(luò)方干預(yù)過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞的實驗結(jié)果

2.2.1 過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞Caspase-1蛋白mRNA表達 圖6結(jié)果顯示：與空白對照組比較，空白質(zhì)粒組Caspase-1蛋白mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與空白質(zhì)粒組比較，過表達質(zhì)粒組Caspase-1蛋白mRNA表達明顯增高（P＜0.001）。

圖6 過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞Caspase-1蛋白mRNA表達Figure 6 Caspase-1 protein mRNA expression in BEAS-2B cells transfected with overexpressed Caspase-1 plasmids

2.2.2 清肺通絡(luò)方對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞增殖活性的影響 圖7結(jié)果顯示：與空白質(zhì)粒組比較，過表達質(zhì)粒組12、24 h細胞增殖活性明顯下降（P＜0.001）；與過表達質(zhì)粒組比較，清肺通絡(luò)方2組干預(yù)12、24 h細胞增殖活性顯著上升（P＜0.05或P＜0.001）。

圖7 清肺通絡(luò)方（QTF）對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞增殖活性的影響Figure 7 Effect of Qingfei Tongluo Prescription on the proliferative activity of BEAS-2B cells transfected with overexpressed Caspase-1 plasmids

2.2.3 清肺通絡(luò)方對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞的Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表達的影響 圖8結(jié)果顯示：與空白質(zhì)粒組比較，過表達質(zhì)粒組細胞中pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表達明顯升高（P＜0.01或P＜0.001）；與過表達質(zhì)粒組比較，清肺通絡(luò)方2組細胞pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表達明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖8 清肺通絡(luò)方（QTF）對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞的pro-Caspase-1、Caspase-1、消皮素D（GSDMD）、消皮素D N端片段（GSDMD-N）表達的影響Figure 8 Effect of Qingfei Tongluo Prescription on the expression of pro-Caspase-1，Caspase-1，GSDMD and GSDMD-N in BEAS-2B cells transfected with overexpressed Caspase-1 plasmids

2.2.4 清肺通絡(luò)方對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞的炎癥因子IL-1β、IL-18含量的影響 圖9結(jié)果顯示：與空白質(zhì)粒組比較，過表達質(zhì)粒組細胞上清液中IL-1β和IL-18含量顯著升高（P＜0.001）；與過表達質(zhì)粒組比較，清肺通絡(luò)方2組細胞上清液中IL-1β、IL-18含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.001）。

圖9 清肺通絡(luò)方（QTF）對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞的炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-18含量的影響Figure 9 Effect of Qingfei Tongluo Prescription on the content of inflammatory factors IL-1βand IL-18 in BEAS-2B cells transfected with overexpressed Caspase-1 plasmids

2.2.5 清肺通絡(luò)方對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞焦亡的影響 圖10結(jié)果顯示：與空白質(zhì)粒組比較，過表達質(zhì)粒組細胞焦亡率顯著上升（P＜0.001）；與過表達質(zhì)粒組比較，清肺通絡(luò)方2組細胞焦亡率顯著下降（P＜0.001）。

2.2.6 清肺通絡(luò)方對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞LDH、Na+-K+-ATP酶活性的影響圖11結(jié)果顯示：與空白質(zhì)粒組比較，過表達質(zhì)粒組LDH活性顯著上升（P＜0.001），Na+-K+-ATP酶活性顯著下降（P＜0.001）；與過表達質(zhì)粒組比較，清肺通絡(luò)方2組LDH活性顯著下降（P＜0.001），Na+-K+-ATP酶活性明顯上升（P＜0.01）。

圖11 清肺通絡(luò)方（QTF）對過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞乳酸脫氫酶（LDH）、Na+-K+-ATP酶活性的影響Figure 11 Effect of Qingfei Tongluo Prescription on LDH and Na+-K+-ATPase activities in BEAS-2B cells transfected with overexpressed Caspase-1 plasmids

3 討論

肺炎支原體（MP）可引起上、下呼吸道感染，在世界范圍內(nèi)具有地方性和流行性[7]，是目前兒童社區(qū)獲得性肺炎最常見的病原體之一，且感染率呈明顯上升趨勢[8]。肺炎支原體肺炎（MPP）患兒可達兒童社區(qū)獲得性肺炎住院病例的40%[9-10]。MP因其具有季節(jié)性、流行性和傳染性的特點，且MPP的發(fā)病特征符合溫邪致病的特點，故可從“溫病”論治。葉天士云“溫邪上受，首先犯肺”，小兒形氣未充，肺臟嬌嫩，易感外邪，MP自口鼻循氣道直侵肺絡(luò)，痹阻氣絡(luò)則氣滯痰凝，痹阻血絡(luò)則營血瘀阻，痰瘀互結(jié)痹阻肺絡(luò)，終使肺失宣肅而發(fā)病[11]。因此，我們提出MPP“肺絡(luò)痹阻”的中醫(yī)病機。清肺通絡(luò)方以“肺絡(luò)”為理論依據(jù)，結(jié)合臨床實踐，用于治療兒童MPP，該方以瀉白散（桑白皮、地骨皮）為基礎(chǔ)，貫穿化痰通絡(luò)（虎杖、紫蘇子、葶藶子）與祛瘀通絡(luò)（桃仁、地龍、半枝蓮）并行的理念，從而恢復(fù)肺絡(luò)氣血運行，通達肺絡(luò)，恢復(fù)肺臟之宣發(fā)肅降的功能。方中：桑白皮瀉肺平喘，利水消腫，可降氣散血，地骨皮涼血除蒸，清肺降火，二者共為君藥；虎杖化痰止咳、活血利濕，桃仁化痰止咳、活血潤腸，地龍清熱、平喘、通絡(luò)、利尿，三藥合用，既能化痰通絡(luò)，又可助君藥降氣平喘，故共為臣藥；半枝蓮清熱解毒、化瘀利尿，紫蘇子降氣消痰，葶藶子瀉肺平喘、利水消腫，共為佐藥；甘草祛痰止咳，調(diào)和諸藥，而為使藥。全方相合，共奏清熱化痰、祛瘀通絡(luò)之效，使肺絡(luò)通暢、宣降有章、氣血復(fù)常，則病邪得去。

本項目組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，清肺通絡(luò)方治療MPP的療效明顯，臨床總有效率達94.67%，顯著優(yōu)于單純西藥治療[12]，可有效縮短退熱時間、改善肺部癥狀和體征，縮短病程，減少抗生素的使用[13]。

MPP的發(fā)病機制，目前尚不完全清楚，主要包括細胞粘附、組織損傷、免疫損傷、細胞凋亡等方面。近期相關(guān)實驗表明，MP感染與細胞焦亡之間關(guān)系密切[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥與細胞焦亡之間也存在一定聯(lián)系[14]。細胞焦亡是一種由炎癥小體引起的細胞程序性裂解死亡方式，可以用來檢測細胞受到的感染或干擾情況[15]，當(dāng)機體受到外界的細菌、病毒或其他病原體的侵襲后會刺激炎癥小體啟動細胞焦亡途徑。細胞焦亡是機體重要的天然免疫反應(yīng)，在拮抗感染和內(nèi)源危險信號中發(fā)揮重要作用。相比細胞凋亡（apoptosis），細胞焦亡發(fā)生更快，并會伴隨大量促炎癥因子的釋放[5]。細胞焦亡途徑包括2種，分別是由Caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡經(jīng)典途徑和由Caspase-4/-5/-11、Caspase-3或Caspase-8介導(dǎo)的細胞焦亡非經(jīng)典途徑[16-18]。在經(jīng)典途徑中，細胞表面模式識別受體與內(nèi)源性或外源性危險信號相互作用觸發(fā)信號通路，誘導(dǎo)ASC的募集形成炎癥小體，從而將pro-Caspase-1轉(zhuǎn)化為有活性的Caspase-1。Caspase-1也稱為白細胞介素轉(zhuǎn)化酶，誘導(dǎo)IL-1β、IL-18成熟，從而切割GSDMD形成GSDMD-C和GSDMD-N。隨后，GSDMD-N在細胞膜的內(nèi)小葉上形成低聚物，并與磷脂酸和磷脂酰絲氨酸相互作用[20]，導(dǎo)致GSDMD誘導(dǎo)的孔隙形成，IL-1β、IL-18分泌[5，18，20]。本研究結(jié)果顯示，MP感染BEAS-2B細胞后Caspase-1、GSDMD-N表達升高，細胞焦亡率上升，提示MP感染激活Caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡經(jīng)典途徑，Caspase-1活化后，切割GSDMD，GSDMD結(jié)構(gòu)的自抑性遭到破壞，使GSDMD-N表達升高。此外，MP感染BEAS-2B細胞后，細胞上清液中炎癥因子表達上升，表明活化的Caspase-1使無活性的pro-IL-1β、pro-IL-18加工為有活性的形式進而分泌到細胞外，從而使兩者表達上升。

LDH參與丙酮酸和乳酸應(yīng)之間的轉(zhuǎn)化，在細胞膜破裂后分泌，因此，被廣泛應(yīng)用于檢測細胞焦亡的發(fā)生。Na+-K+-ATP酶廣泛表達于各種組織和器官[21]，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)[22]。本研究結(jié)果表明，MP感染引起細胞發(fā)生焦亡，細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞、內(nèi)環(huán)境紊亂，導(dǎo)致LDH活性升高、Na+-K+-ATP酶活性下降。然而，單靠LDH活性改變不足以量化細胞焦亡，在其他類型的細胞死亡過程中LDH也會釋放，比如細胞壞死和凋亡。因此，LDH活性的檢測結(jié)果應(yīng)與Caspase-1的檢測結(jié)果結(jié)合起來進行綜合分析[23]。

質(zhì)粒常被用作基因的載體，可高效、穩(wěn)定表達所攜帶的信息。本研究構(gòu)建了過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染模型，過表達質(zhì)粒組檢測結(jié)果顯示，細胞中Caspase-1、GSDMD-N表達及細胞焦亡率均升高，細胞上清液中炎癥因子的含量上升，LDH和Na+-K+-ATP酶的活性失調(diào)。與MP感染BEAS-2B細胞的結(jié)果相似，再次顯示出Caspase-1在細胞焦亡過程中起著重要的調(diào)控作用[24-25]。

清肺通絡(luò)方干預(yù)后，MP感染BEAS-2B細胞、過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞焦亡情況得到明顯改善，有效抑制了Caspase-1、GSDMD-N的表達，減少IL-1β、IL-18的釋放，降低細胞焦亡率，恢復(fù)LDH、Na+-K+-ATP酶活性水平。以上結(jié)果提示，清肺通絡(luò)方可以通過抑制Caspase-1有效調(diào)控細胞焦亡經(jīng)典途徑中相關(guān)因子在MP感染細胞模型及過表達Caspase-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞模型中的表達。根據(jù)本實驗結(jié)果，可考慮將清肺通絡(luò)方作為Caspase-1抑制劑的替代藥物用于臨床治療。

綜上所述，MP可以激活Caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡，使得GSDMD-N表達升高、炎癥因子釋放、相關(guān)酶活性失調(diào)，而清肺通絡(luò)方能夠通過抑制Caspase-1的激活，緩解細胞焦亡進程，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗MPP作用。本研究結(jié)果可為清肺通絡(luò)方治療小兒MPP提供更多的實驗依據(jù)，也可為治療該疾病藥物的開發(fā)提供新的思路和借鑒。