鄭國洪， 孫斌， 王潔瓊， 楊正明

（1.浙江省舟山市中醫(yī)院急診骨傷科，浙江舟山 316000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨科，浙江杭州 310000）

踝關(guān)節(jié)骨折是臨床常見的關(guān)節(jié)內(nèi)創(chuàng)傷型骨折之一，發(fā)生率逐年升高[1]。踝關(guān)節(jié)是人體第一負(fù)重關(guān)節(jié)，最高可承受5倍個(gè)人體質(zhì)量，但其關(guān)節(jié)面小，離地面近，承重力無法充分緩沖，因此極易受損[2]。目前，關(guān)于踝關(guān)節(jié)骨折的治療方案尚不統(tǒng)一，臨床多采用鎮(zhèn)痛、抗炎藥物配合外科手術(shù)的治療方法以達(dá)到增強(qiáng)關(guān)節(jié)穩(wěn)定性、抑制炎癥的效果，但手術(shù)創(chuàng)傷易引發(fā)關(guān)節(jié)軟組織粘連且術(shù)后抗炎藥物不良反應(yīng)較多，并不適用于全部患者尤其是老齡患者[3]。淫羊藿苷（icariin）是常用中藥淫羊藿[為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔 毛 淫 羊 藿Epimedium pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai的干燥葉]的主要有效成分之一。有研究[4-6]表明，淫羊藿苷在促進(jìn)骨折愈合和治療骨缺損方面有著顯著作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究建立踝關(guān)節(jié)骨折創(chuàng)傷大鼠模型，進(jìn)一步觀察淫羊藿苷的治療作用及機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用治療骨折提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 55只SPF級8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量（280±20）g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2019-0002。本研究方案已經(jīng)浙江省舟山市中醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物、試劑與儀器 淫羊藿苷（純度：98%，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：B21576，分子量：676.662，分子式：C33H40O15，分子結(jié)構(gòu)見圖1）；復(fù)方骨肽注射液（南京新百藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H32020004）?？咕剖崴嵝粤姿崦福═RAP）染色試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）；兔抗大鼠Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）抗體（英國Santa公司）。SkyScan活體三維斷層掃描儀（德國Bruker公司）；SZX7顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；Doc EZ凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

圖1 淫羊藿苷分子結(jié)構(gòu)Figure 1 Molecular structure of icariin

1.3 建立踝關(guān)節(jié)骨折大鼠模型[7]大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉，備皮消毒后，仰臥位固定于手術(shù)臺，右下肢屈膝90°，踝關(guān)節(jié)充分外展，內(nèi)踝處做1 cm長度切口，分離皮下筋膜，牽拉肌腱，暴露踝關(guān)節(jié)，骨鑿37°鑿入內(nèi)踝，生理鹽水沖洗后縫合切口。術(shù)前腹腔注射青霉素預(yù)防感染，術(shù)后給予曲馬多鎮(zhèn)痛，每日1次，持續(xù)3 d。術(shù)后即刻行X線攝片，以踝關(guān)節(jié)斜形或橫形骨折，骨折端內(nèi)固定效果理想，未發(fā)生明顯移位為建模成功標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果成功建立踝關(guān)節(jié)骨折模型50只。

1.4 分組與干預(yù) 將50只踝關(guān)節(jié)骨折大鼠隨機(jī)分為模型組，淫羊藿苷低、中、高劑量組及陽性藥組，每組10只。建模后次日，根據(jù)黃繼漢等《藥理試驗(yàn)中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》[8]進(jìn)行給藥劑量換算。淫羊藿苷低、中、高劑量組腹腔注射淫羊藿苷生理鹽水2.5 mL（分別含淫羊藿苷30、60、120 mg/kg）[9]，陽性藥組腹腔注射復(fù)方骨肽注射液與生理鹽水混合溶液2.5 mL（含復(fù)方骨肽注射液5 mL/kg）[10]，模型組腹腔注射生理鹽水2.5 mL。每日1次，持續(xù)4周。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 Micro-CT活體掃描 干預(yù)2、4周后做三維斷層掃描，戊巴比妥鈉麻醉后俯臥位固定于手術(shù)臺，屈曲雙下肢。設(shè)定分辨率47μm，行Micro-CT掃描，沿骨痂上下各取50個(gè)掃描層面。在骨折處建立三維感興趣區(qū)，CTAn軟件分析結(jié)果，計(jì)算骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）與骨體積分?jǐn)?shù)（bonevolume/total volume，BV/TV）。

1.5.2 生物力學(xué)測試 末次Micro-CT活體掃描結(jié)束后，過量麻醉處死大鼠，取其右下肢踝關(guān)節(jié)，固定兩端后行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。以所取踝關(guān)節(jié)中點(diǎn)為加載點(diǎn)，頂端、底端跨距分別為8、20 mm，記錄剛度（骨頭在不被破壞的情況下能夠承受的力的大小的能力）及最大載荷（骨頭最大力學(xué)載荷耐受程度）。

1.5.3 TRAP染色法檢測破骨細(xì)胞數(shù)量 生物力學(xué)測試完成后，每組取5只大鼠包括骨痂組織的踝關(guān)節(jié)，置于4%福爾馬林溶液中固定72 h，移至10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣液，6周后常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，以切片機(jī)切為4μm厚度，連續(xù)切片。根據(jù)TRAP染色試劑盒說明書步驟染色切片，置于顯微鏡下觀察。黃褐色細(xì)胞為陽性破骨細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)不相鄰的視野，記錄每個(gè)視野破骨細(xì)胞數(shù)，求其均值。

1.5.4 HE染色觀察骨痂組織學(xué)變化 取各組剩余5只大鼠踝關(guān)節(jié)，切取骨折處上下6 mm×6 mm骨痂組織，分成2份。一份置于10%中性甲醛固定48 h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片機(jī)切為4μm厚度連續(xù)切片；另一份投入液氮中保存。二甲苯脫蠟踝關(guān)節(jié)切片，水化后自來水沖洗，移至蘇木素染液內(nèi)染色5 min。自來水沖洗，分化液分化。自來水沖洗，移入藍(lán)化液返藍(lán)，伊紅液染色2 min。自來水漂洗，常規(guī)脫水、透明。滴入中性樹脂封固，置于顯微鏡下觀察骨痂組織病理變化，并拍照記錄。

1.5.5 Western Blot法檢測骨痂組織Runx2蛋白表達(dá)水平 取液氮中保存的骨痂組織，研磨后裂解，以9 000 r/min（離心半徑10 cm）離心15 min，取上清，BCA法定量蛋白濃度。取40μg樣本蛋白，混合4倍體積上樣緩沖液，金屬浴煮沸5 min。同條件下離心取上清，恒壓下行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，濕轉(zhuǎn)至膜。加入封閉液封閉2 h，TBST洗膜，加入Runx2一抗（1∶500體積比稀釋），4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000體積比稀釋），室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，暗盒顯影。經(jīng)凝膠成像分析儀分析蛋白條帶灰度值，Runx2蛋白相對表達(dá)量以Runx2蛋白/內(nèi)參GAPDH灰度值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），多組樣本資料比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步以LSD-t法行兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨重建指標(biāo)比較 表1結(jié)果顯示：干預(yù)2、4周后，與模型組同期比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組和陽性藥組Tb.N增加，BV/TV值升高（P＜0.05），淫羊藿苷各劑量組作用效果呈劑量依賴性；但淫羊藿苷各劑量組Tb.N、BV/TV值均低于陽性藥組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠骨重建指標(biāo)比較Table 1 Comparison of bone reconstruction indexes among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠骨重建指標(biāo)比較Table 1 Comparison of bone reconstruction indexes among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性藥組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷低劑量組比較；④P＜0.05，與淫羊藿苷中劑量組比較

組別模型組淫羊藿苷低劑量組淫羊藿苷中劑量組淫羊藿苷高劑量組陽性藥組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 Tb.N/（個(gè)·mm-1）給藥2周后2.09±0.41 2.49±0.42①②2.90±0.44①②③3.32±0.45①②③④3.79±0.53①11.926＜0.001給藥4周后2.65±0.43 3.07±0.45①②3.51±0.48①②③3.98±0.51①②③④4.49±0.57①21.928＜0.001 BV/TV值給藥2周后0.21±0.03 0.25±0.04①②0.30±0.05①②③0.36±0.06①②③④0.41±0.04①32.010＜0.001給藥4周后0.26±0.03 0.30±0.04①②0.34±0.04①②③0.39±0.05①②③④0.45±0.06①27.304＜0.001

2.2 各組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)比較 表2結(jié)果顯示：與模型組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組和陽性藥組最大載荷、剛度增加（P＜0.05），淫羊藿苷各劑量組作用效果呈劑量依賴性；但淫羊藿苷各劑量組最大載荷、剛度均低于陽性藥組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)比較Table 2 Comparison of biomechanical indexes among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)比較Table 2 Comparison of biomechanical indexes among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性藥組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷低劑量組比較；④P＜0.05，與淫羊藿苷中劑量組比較

組別模型組淫羊藿苷低劑量組淫羊藿苷中劑量組淫羊藿苷高劑量組陽性藥組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10最大載荷/N 34.25±2.39 37.65±3.01①②40.22±2.38①②③43.02±2.60①②③④47.21±3.11①33.441＜0.001剛度/（N·mm-1）80.87±9.65 90.24±10.21①②101.52±11.36①②③113.29±13.35①②③④125.67±12.68①23.899＜0.001

2.3 各組大鼠骨痂組織破骨細(xì)胞數(shù)量比較 表3、圖2結(jié)果顯示：與模型組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組和陽性藥組骨痂組織破骨細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05），淫羊藿苷各劑量組作用效果呈劑量依賴性；但淫羊藿苷各劑量組骨痂組織破骨細(xì)胞數(shù)量均高于陽性藥組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠骨痂組織破骨細(xì)胞數(shù)量比較Table 3 Comparison of number of osteoclasts in callus tissue among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠骨痂組織破骨細(xì)胞數(shù)量比較Table 3 Comparison of number of osteoclasts in callus tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性藥組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷低劑量組比較；④P＜0.05，與淫羊藿苷中劑量組比較

組別模型組淫羊藿苷低劑量組淫羊藿苷中劑量組淫羊藿苷高劑量組陽性藥組F值P值鼠數(shù)/只55555破骨細(xì)胞數(shù)/（個(gè)·視野-1）4.20±0.57 3.20±0.45①②2.40±0.29①②③1.20±0.14①②③④0.60±0.07①83.805＜0.001

2.4 各組大鼠骨痂組織學(xué)改變比較 圖3結(jié)果顯示：模型組骨小梁不具有明顯的方向性，成骨細(xì)胞功能不活躍，骨小梁較細(xì)；淫羊藿苷低、中劑量組可見較多骨性骨痂，骨小梁較粗，部分成熟，存在明顯礦化，排列較整齊；淫羊藿苷高劑量組、陽性藥物組可見軟骨性及纖維性骨痂形成，軟骨性骨痂邊緣鈣化明顯，骨外膜下可見成骨細(xì)胞形成骨小梁。

圖3 各組骨痂組織HE染色結(jié)果（×200）Figure 3 HE staining results of the callus tissue in various groups（×200）

2.5 各組大鼠骨痂組織Runx2蛋白表達(dá)量比較表4、圖4結(jié)果顯示：與模型組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組和陽性藥組骨痂組織Runx2蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），淫羊藿苷各劑量組作用效果呈劑量依賴性；但淫羊藿苷各劑量組骨痂組織Runx2蛋白表達(dá)量均低于陽性藥組（P＜0.05）。

表4 各組大鼠骨痂組織Runx2蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of Runx2 protein expression in callus tissue among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠骨痂組織Runx2蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of Runx2 protein expression in callus tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽性藥組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷低劑量組比較；④P＜0.05，與淫羊藿苷中劑量組比較

組別模型組淫羊藿苷低劑量組淫羊藿苷中劑量組淫羊藿苷高劑量組陽性藥組F值P值鼠數(shù)/只55555 Runx2蛋白相對表達(dá)量0.09±0.01 0.20±0.02①②0.38±0.05①②③0.53±0.06①②③④0.72±0.08①122.365＜0.001

圖4 各組骨痂組織Runx2蛋白Western Blot電泳圖Figure 4 Western Blot electrophoretogram of Runx2 protein in callus tissue

3 討論

踝關(guān)節(jié)骨折是由于脛腓骨下端沖擊與之相連距骨，發(fā)生翻轉(zhuǎn)、扭動而造成的下肢骨損傷，多發(fā)生于體育鍛煉、生活勞動時(shí)，以踝部腫脹、壓痛，皮下瘀斑，踝關(guān)節(jié)無法自由活動為主要臨床表現(xiàn)[11]。骨折，愈合是骨折處組織反復(fù)進(jìn)行吸收與形成的過程，其中破骨細(xì)胞主導(dǎo)骨吸收，成骨細(xì)胞主導(dǎo)骨形成，二者相互抑制形成動態(tài)平衡，但由于炎癥反應(yīng)的存在，成骨-破骨平衡狀態(tài)被打破，破骨細(xì)胞優(yōu)勢明顯，成骨功能降低，骨愈合放緩，導(dǎo)致病程延長[12]。因此，尋找抑制破骨細(xì)胞、提升成骨能力的新藥物或手段是治療踝關(guān)節(jié)骨折的關(guān)鍵。

中醫(yī)治療骨折歷史悠久，將骨折治療定為“瘀去”“新生”“骨合”三期，現(xiàn)代中醫(yī)在三期辨證的基礎(chǔ)上靈活運(yùn)用，認(rèn)為其病位在于腎、肝，主要病機(jī)為骨斷筋傷，血瘀不散，經(jīng)絡(luò)阻滯，累積傷腎，腎陽虧虛，以致筋脈失養(yǎng)、骨髓不愈，故治療應(yīng)以舒筋活血、補(bǔ)腎壯陽為主[13]。淫羊藿溫燥助陽之性較強(qiáng)，除長于補(bǔ)命火、壯腎陽外，其通痹、強(qiáng)筋骨、治風(fēng)冷疼痛癥較佳，常用于治療性機(jī)能衰退、腰膝無力、風(fēng)濕痹痛、四肢麻木等癥。《別錄》言淫羊藿能“堅(jiān)筋骨”。《日華諸家本草》曰淫羊藿治“一切冷風(fēng)勞氣，筋骨攣急，四肢不仁，補(bǔ)腰膝”。《本草備要》云淫羊藿能“補(bǔ)命門，益精氣，堅(jiān)筋骨，利小便”?！侗静萸笳妗分赋觯骸耙蜣綒馕陡蕼?，則能補(bǔ)火助陽，兼有辛香，則冷可除而風(fēng)可散耳?！币蜣杰帐菑囊蜣街刑崛〉膯误w黃酮類化合物，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)淫羊藿苷干預(yù)2、4周后，踝關(guān)節(jié)骨折大鼠Tb.N、最大載荷、剛度增加，BV/TV值升高，破骨細(xì)胞數(shù)減少，且呈劑量依賴性，提示淫羊藿苷可提升骨重建能力及生物力學(xué)性能，抑制破骨細(xì)胞形成。

Runx2屬于轉(zhuǎn)錄因子Runx家族成員，是一種異二聚體核蛋白，作為骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄蛋白，參與多種骨骼系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展[14]。Runx2是成骨分化前期重要的上游因子，可調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育為成骨或軟骨細(xì)胞，并直接調(diào)控成骨細(xì)胞特異性基因如OSX表達(dá)[15]。此外，Runx2的羧基端SMID/NMTS區(qū)域是骨分化的必需片段[16]。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，骨折后Runx2在脛骨組織中的表達(dá)水平明顯降低，上調(diào)其表達(dá)后可提升骨密度及最大載荷、彎曲強(qiáng)度、彈性應(yīng)力、彈性應(yīng)變，在骨組織修復(fù)、促進(jìn)脛骨骨折愈合中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)淫羊藿苷干預(yù)后骨痂組織Runx2蛋白表達(dá)量升高，且呈劑量依賴性，提示淫羊藿苷可能通過上調(diào)Runx2蛋白表達(dá)抑制踝關(guān)節(jié)骨折創(chuàng)傷大鼠破骨細(xì)胞分化。

綜上所述，淫羊藿苷可促進(jìn)踝關(guān)節(jié)骨折創(chuàng)傷大鼠骨重建，抑制破骨細(xì)胞形成，提高生物力學(xué)性能，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Runx2蛋白表達(dá)有關(guān)；但淫羊藿苷作用效果不及復(fù)方骨肽注射液，其醫(yī)用生物有待進(jìn)一步的深入研究。