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        超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定龍膽瀉肝丸中木通苯乙醇苷B含量*

        2022-12-08 09:20:00周云峰鄧杰華黃招光黃炳泉楊建冬
        中國(guó)藥業(yè) 2022年22期
        關(guān)鍵詞:木通項(xiàng)下藥材

        周云峰,鄧杰華,黃招光,吳 喆,黃炳泉,楊建冬

        (江西省宜春市檢驗(yàn)檢測(cè)中心,江西 宜春 336000)

        龍膽瀉肝丸(水丸)的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為2020年版《中國(guó)藥典(一部)》[1],其對(duì)方中龍膽、澤瀉、甘草、梔子、黃芩、柴胡、車前子、地黃8種藥味進(jìn)行了定性鑒別或含量測(cè)定[2-3],但對(duì)方中木通未進(jìn)行質(zhì)量控制,現(xiàn)有報(bào)道亦鮮見。木通為木通科木通Akebia quinata(Thunb.)Decne.、三葉木通Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.或白木通Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.var.Australis(Diels)Rehd.的干燥藤莖,品種繁雜。與木通名稱相近的有川木通[4-5]、關(guān)木通[6-7]和甘木通[8],三者均不屬于木通科,與木通的基源差別較大,而在我國(guó)中藥使用史上木通品種常有混用現(xiàn)象[9-11]。為此,本研究中以木通苯乙醇苷B為定量指標(biāo),采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法考查制劑中木通的質(zhì)量水平,為提升該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?,F(xiàn)報(bào)道如下。

        1 儀器與試藥

        儀器:H-class型超高效液相色譜-xevo TQD型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司);MS205DU型十萬分之一電子天平、TLE 204E型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);PL-S60型超聲波清洗儀(東莞康士潔超聲波科技有限公司)。

        試藥:龍膽瀉肝丸[江西省各地級(jí)市17家企業(yè)(記為N1-N17),共36批(樣品信息見表1),規(guī)格包括每100粒6 g,每瓶60 g,每袋3 g或6 g];木通苯乙醇苷B對(duì)照品(批號(hào)為111910-201604,含量98.2%)、甘木通對(duì)照藥材(批號(hào)為121443-201102)、川木通對(duì)照藥材(批號(hào)為121409-202003),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;木通對(duì)照藥材(湖南省松齡堂中藥飲片有限公司,批號(hào)為201101)、關(guān)木通對(duì)照藥材(成都德思特生物技術(shù)有限公司,批號(hào)為DST201219-072),均由江西省宜春市食品藥品檢驗(yàn)所楊建冬主任中藥師鑒定為正品;甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純,其余試劑為分析純,水為純化水。

        表1 樣品信息及含量測(cè)定結(jié)果(μg/g,n=3)Tab.1 Information of samples and results of content determination of calceorioside B in samples(μg/g,n=3)

        2 方法與結(jié)果

        2.1 試驗(yàn)條件

        色譜條件:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫(0~13 min時(shí)90%B→25%B,13~17 min時(shí)25%B,17~17.01 min時(shí)25%B→90%B,17.01~20 min時(shí)90%B);流速為1.0 mL/min;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為10 μL。

        質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI-),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);毛細(xì)管電壓0.5 kV;錐孔電壓-55 V,錐孔氣流量50 L/h;脫溶劑氣流量900 L/h,脫溶劑氣溫度550℃;木通苯乙醇苷B檢測(cè)離子對(duì)m/z477→161(定量)、m/z477→133和m/z477→315。

        2.2 溶液制備

        取木通苯乙醇苷B對(duì)照品適量,精密稱定,加70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為5.170 μg/mL的對(duì)照品溶液。取樣品細(xì)粉0.5 g,精密稱定,置100 mL容量瓶中,加入70%甲醇80 mL,超聲(功率250 W,頻率50 kHz,下同)處理60 min,放冷至室溫,加70%甲醇定容,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。取木通對(duì)照藥材0.05 g,精密稱定,按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液,同法制備川木通、關(guān)木通、甘木通對(duì)照藥材溶液,即偽品對(duì)照藥材溶液。按龍膽瀉肝丸處方和工藝制備缺木通的陰性樣品,并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

        2.3 方法學(xué)考察

        專屬性試驗(yàn):取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、偽品對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量,按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液圖譜中,出現(xiàn)與木通對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰,質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度較高。陰性對(duì)照品溶液的圖譜中雖含有1個(gè)與對(duì)照品溶液保留時(shí)間相似的色譜峰,但質(zhì)譜響應(yīng)很弱。提取陰性對(duì)照品溶液的相應(yīng)離子對(duì)發(fā)現(xiàn),定量離子對(duì)m/z477→161的峰面積可忽略不計(jì),定性離子對(duì)m/z477→315無與木通苯乙醇苷B保留時(shí)間一致的色譜峰,且通過子離子掃描發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照品溶液與對(duì)照品溶液圖譜的一、二級(jí)質(zhì)譜不一致,表明陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無干擾,專屬性良好。另外對(duì)川木通、關(guān)木通、甘木通對(duì)照藥材溶液進(jìn)行分析,其色譜圖中均未出現(xiàn)與對(duì)照品溶液圖譜保留時(shí)間一致的色譜峰[12-13]。詳見圖1。

        圖1 總離子流圖1.Calccorioside BA.Reference solution B.Akebiae Caulis reference solution C.Test solution D.Negative reference solution E.Aristolochiae Caulis medicinal solutionF.Clematidis Armandii Caulis medicinal solution G.Clematidis Filamentosae Folium medicinal solutionFig.1 Total ion chromatograms

        線性關(guān)系考察:分別精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.4,1.0,2.0,4.0,10.0 mL,置10 mL容量瓶中,加70%甲醇定容,制成系列對(duì)照品溶液。精密量取10 μL,按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(X,μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=29 941X-227.86(r=0.999 9)。結(jié)果表明,木通苯乙醇苷B質(zhì)量濃度在0.103 4~5.170 0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

        精密度試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄離子豐度。結(jié)果木通苯乙醇苷B峰面積的RSD為2.58%(n=6),表明儀器精密度良好。

        穩(wěn)定性試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量,分別于室溫下放置0,2,4,6,8,24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄離子豐度。結(jié)果,木通苯乙醇苷B峰面積的RSD為3.56%(n=6),表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

        重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取樣品(批號(hào)13200607)適量,共6份,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄離子豐度并計(jì)算含量。結(jié)果木通苯乙醇苷B含量平均值的RSD為3.89%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

        加樣回收試驗(yàn):取已知含量樣品(批號(hào)13200607)適量,共6份,分別加入一定質(zhì)量濃度的木通苯乙醇苷B對(duì)照品溶液適量,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄離子豐度并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表2。

        表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of the recovery test(n=6)

        2.4 樣品含量測(cè)定

        取36批樣品各適量,分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定,平行測(cè)定3次,記錄離子豐度并計(jì)算樣品含量,結(jié)果見表1。36批樣品均含有木通苯乙醇苷B,含量為14.42~255.02 μg/g。為了解企業(yè)間樣品中木通苯乙醇苷B含量的差異情況,對(duì)同一企業(yè)的不同批次樣品的含量取平均值,結(jié)果見圖2??梢?,不同企業(yè)的樣品含量差異顯著,推測(cè)各企業(yè)所采購(gòu)的樣品中木通原料質(zhì)量差異較大。

        圖2 各企業(yè)樣品中木通苯乙醇苷B平均含量分布圖Fig.2 Distribution of average content of calceorioside B in samples from different enterprises

        3 討論

        預(yù)試驗(yàn)中流動(dòng)相考察了甲醇-0.02%氨溶液、乙腈-0.02%氨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液4個(gè)系統(tǒng),通過比較離子豐度、目標(biāo)化合物色譜峰形和儀器耐用性等因素,選擇了乙腈-0.1%甲酸溶液(梯度洗脫)作為流動(dòng)相;質(zhì)譜參數(shù)方面選擇了較穩(wěn)定的MRM模式進(jìn)行定量分析,且在負(fù)離子模式下,木通苯乙醇苷B的離子豐度較高且穩(wěn)定。

        木通苯乙醇苷B易溶于70%甲醇[14],故以70%甲醇為提取溶劑,采用超聲提取,比較超聲30,40,50,60,70 min結(jié)果,發(fā)現(xiàn)超聲50 min后,木通苯乙醇苷B成分即提取完全,考慮方法的可靠性,最終選擇加入70%甲醇超聲60 min作為提取方法。為排除假陽性成分對(duì)含量測(cè)定的干擾,對(duì)所有市售樣品和木通對(duì)照藥材溶液進(jìn)行了子離子掃描,其主要子離子均為477,315,179,161,135,101,89,與木通苯乙醇苷B對(duì)照品的碎片離子基本一致,且通過計(jì)算MRM模式下的離子豐度可知,其結(jié)果均在對(duì)照品的離子豐度誤差范圍內(nèi),而在陰性對(duì)照品和偽品對(duì)照藥材中均未檢出,說明該含量測(cè)定方法可行。

        本研究中采用UPLC-MS/MS法建立了水丸中木通的質(zhì)量控制方法,通過對(duì)木通苯乙醇苷B的含量分析可知,各企業(yè)樣品含量差異顯著,表明木通原料質(zhì)量穩(wěn)定性較低,有必要對(duì)龍膽瀉肝丸中木通苯乙醇苷B含量擬定限度值,此項(xiàng)工作有待進(jìn)一步研究。

        考慮到有些不法商家可能會(huì)利用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不完善的監(jiān)管漏洞,在生產(chǎn)過程中以假亂真、以次充好、不投料[15-16],故進(jìn)一步補(bǔ)充完善龍膽瀉肝丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、建立制劑中木通含量測(cè)定方法對(duì)于保障該制劑的安全性、有效性具有重要意義。

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