周云峰，鄧杰華，黃招光，吳 喆，黃炳泉，楊建冬

（江西省宜春市檢驗檢測中心，江西 宜春 336000）

龍膽瀉肝丸（水丸）的現(xiàn)行質(zhì)量標準為2020年版《中國藥典（一部）》［1］，其對方中龍膽、澤瀉、甘草、梔子、黃芩、柴胡、車前子、地黃8種藥味進行了定性鑒別或含量測定［2-3］，但對方中木通未進行質(zhì)量控制，現(xiàn)有報道亦鮮見。木通為木通科木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三葉木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.var.Australis（Diels）Rehd.的干燥藤莖，品種繁雜。與木通名稱相近的有川木通［4-5］、關木通［6-7］和甘木通［8］，三者均不屬于木通科，與木通的基源差別較大，而在我國中藥使用史上木通品種常有混用現(xiàn)象［9-11］。為此，本研究中以木通苯乙醇苷B為定量指標，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法考查制劑中木通的質(zhì)量水平，為提升該制劑的質(zhì)量標準提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：H-class型超高效液相色譜-xevo TQD型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；MS205DU型十萬分之一電子天平、TLE 204E型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PL-S60型超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

試藥：龍膽瀉肝丸［江西省各地級市17家企業(yè)（記為N1-N17），共36批（樣品信息見表1），規(guī)格包括每100粒6 g，每瓶60 g，每袋3 g或6 g］；木通苯乙醇苷B對照品（批號為111910-201604，含量98.2%）、甘木通對照藥材（批號為121443-201102）、川木通對照藥材（批號為121409-202003），均購自中國食品藥品檢定研究院；木通對照藥材（湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，批號為201101）、關木通對照藥材（成都德思特生物技術有限公司，批號為DST201219-072），均由江西省宜春市食品藥品檢驗所楊建冬主任中藥師鑒定為正品；甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

表1 樣品信息及含量測定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.1 Information of samples and results of content determination of calceorioside B in samples（μg/g，n=3）

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～13 min時90%B→25%B，13～17 min時25%B，17～17.01 min時25%B→90%B，17.01～20 min時90%B）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI-），多反應監(jiān)測模式（MRM）；毛細管電壓0.5 kV；錐孔電壓-55 V，錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量900 L/h，脫溶劑氣溫度550℃；木通苯乙醇苷B檢測離子對m/z477→161（定量）、m/z477→133和m/z477→315。

2.2 溶液制備

取木通苯乙醇苷B對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為5.170 μg/mL的對照品溶液。取樣品細粉0.5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入70%甲醇80 mL，超聲（功率250 W，頻率50 kHz，下同）處理60 min，放冷至室溫，加70%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取木通對照藥材0.05 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液，同法制備川木通、關木通、甘木通對照藥材溶液，即偽品對照藥材溶液。按龍膽瀉肝丸處方和工藝制備缺木通的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取上述供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、偽品對照藥材溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液圖譜中，出現(xiàn)與木通對照藥材溶液、對照品溶液保留時間一致的色譜峰，質(zhì)譜響應強度較高。陰性對照品溶液的圖譜中雖含有1個與對照品溶液保留時間相似的色譜峰，但質(zhì)譜響應很弱。提取陰性對照品溶液的相應離子對發(fā)現(xiàn)，定量離子對m/z477→161的峰面積可忽略不計，定性離子對m/z477→315無與木通苯乙醇苷B保留時間一致的色譜峰，且通過子離子掃描發(fā)現(xiàn)陰性對照品溶液與對照品溶液圖譜的一、二級質(zhì)譜不一致，表明陰性對照品溶液對測定無干擾，專屬性良好。另外對川木通、關木通、甘木通對照藥材溶液進行分析，其色譜圖中均未出現(xiàn)與對照品溶液圖譜保留時間一致的色譜峰［12-13］。詳見圖1。

圖1 總離子流圖1.Calccorioside BA.Reference solution B.Akebiae Caulis reference solution C.Test solution D.Negative reference solution E.Aristolochiae Caulis medicinal solutionF.Clematidis Armandii Caulis medicinal solution G.Clematidis Filamentosae Folium medicinal solutionFig.1 Total ion chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2項下對照品溶液0.4，1.0，2.0，4.0，10.0 mL，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，制成系列對照品溶液。精密量取10 μL，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=29 941X-227.86（r=0.999 9）。結(jié)果表明，木通苯乙醇苷B質(zhì)量濃度在0.103 4～5.170 0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄離子豐度。結(jié)果木通苯乙醇苷B峰面積的RSD為2.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，24 h時按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄離子豐度。結(jié)果，木通苯乙醇苷B峰面積的RSD為3.56%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：精密稱取樣品（批號13200607）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄離子豐度并計算含量。結(jié)果木通苯乙醇苷B含量平均值的RSD為3.89%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號13200607）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的木通苯乙醇苷B對照品溶液適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄離子豐度并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取36批樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進樣測定，平行測定3次，記錄離子豐度并計算樣品含量，結(jié)果見表1。36批樣品均含有木通苯乙醇苷B，含量為14.42～255.02 μg/g。為了解企業(yè)間樣品中木通苯乙醇苷B含量的差異情況，對同一企業(yè)的不同批次樣品的含量取平均值，結(jié)果見圖2?？梢?，不同企業(yè)的樣品含量差異顯著，推測各企業(yè)所采購的樣品中木通原料質(zhì)量差異較大。

圖2 各企業(yè)樣品中木通苯乙醇苷B平均含量分布圖Fig.2 Distribution of average content of calceorioside B in samples from different enterprises

3 討論

預試驗中流動相考察了甲醇-0.02%氨溶液、乙腈-0.02%氨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液4個系統(tǒng)，通過比較離子豐度、目標化合物色譜峰形和儀器耐用性等因素，選擇了乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）作為流動相；質(zhì)譜參數(shù)方面選擇了較穩(wěn)定的MRM模式進行定量分析，且在負離子模式下，木通苯乙醇苷B的離子豐度較高且穩(wěn)定。

木通苯乙醇苷B易溶于70%甲醇［14］，故以70%甲醇為提取溶劑，采用超聲提取，比較超聲30，40，50，60，70 min結(jié)果，發(fā)現(xiàn)超聲50 min后，木通苯乙醇苷B成分即提取完全，考慮方法的可靠性，最終選擇加入70%甲醇超聲60 min作為提取方法。為排除假陽性成分對含量測定的干擾，對所有市售樣品和木通對照藥材溶液進行了子離子掃描，其主要子離子均為477，315，179，161，135，101，89，與木通苯乙醇苷B對照品的碎片離子基本一致，且通過計算MRM模式下的離子豐度可知，其結(jié)果均在對照品的離子豐度誤差范圍內(nèi)，而在陰性對照品和偽品對照藥材中均未檢出，說明該含量測定方法可行。

本研究中采用UPLC-MS/MS法建立了水丸中木通的質(zhì)量控制方法，通過對木通苯乙醇苷B的含量分析可知，各企業(yè)樣品含量差異顯著，表明木通原料質(zhì)量穩(wěn)定性較低，有必要對龍膽瀉肝丸中木通苯乙醇苷B含量擬定限度值，此項工作有待進一步研究。

考慮到有些不法商家可能會利用現(xiàn)行標準不完善的監(jiān)管漏洞，在生產(chǎn)過程中以假亂真、以次充好、不投料［15-16］，故進一步補充完善龍膽瀉肝丸的質(zhì)量標準、建立制劑中木通含量測定方法對于保障該制劑的安全性、有效性具有重要意義。