周云峰，鄧杰華，黃招光，吳 喆，黃炳泉，楊建冬

（江西省宜春市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 宜春 336000）

龍膽瀉肝丸（水丸）的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為2020年版《中國(guó)藥典（一部）》［1］，其對(duì)方中龍膽、澤瀉、甘草、梔子、黃芩、柴胡、車前子、地黃8種藥味進(jìn)行了定性鑒別或含量測(cè)定［2-3］，但對(duì)方中木通未進(jìn)行質(zhì)量控制，現(xiàn)有報(bào)道亦鮮見。木通為木通科木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三葉木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.var.Australis（Diels）Rehd.的干燥藤莖，品種繁雜。與木通名稱相近的有川木通［4-5］、關(guān)木通［6-7］和甘木通［8］，三者均不屬于木通科，與木通的基源差別較大，而在我國(guó)中藥使用史上木通品種常有混用現(xiàn)象［9-11］。為此，本研究中以木通苯乙醇苷B為定量指標(biāo)，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法考查制劑中木通的質(zhì)量水平，為提升該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：H-class型超高效液相色譜-xevo TQD型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；MS205DU型十萬分之一電子天平、TLE 204E型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PL-S60型超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

試藥：龍膽瀉肝丸［江西省各地級(jí)市17家企業(yè)（記為N1-N17），共36批（樣品信息見表1），規(guī)格包括每100粒6 g，每瓶60 g，每袋3 g或6 g］；木通苯乙醇苷B對(duì)照品（批號(hào)為111910-201604，含量98.2%）、甘木通對(duì)照藥材（批號(hào)為121443-201102）、川木通對(duì)照藥材（批號(hào)為121409-202003），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；木通對(duì)照藥材（湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，批號(hào)為201101）、關(guān)木通對(duì)照藥材（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為DST201219-072），均由江西省宜春市食品藥品檢驗(yàn)所楊建冬主任中藥師鑒定為正品；甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

表1 樣品信息及含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.1 Information of samples and results of content determination of calceorioside B in samples（μg/g，n=3）

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～13 min時(shí)90%B→25%B，13～17 min時(shí)25%B，17～17.01 min時(shí)25%B→90%B，17.01～20 min時(shí)90%B）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓0.5 kV；錐孔電壓-55 V，錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量900 L/h，脫溶劑氣溫度550℃；木通苯乙醇苷B檢測(cè)離子對(duì)m/z477→161（定量）、m/z477→133和m/z477→315。

2.2 溶液制備

取木通苯乙醇苷B對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為5.170 μg/mL的對(duì)照品溶液。取樣品細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入70%甲醇80 mL，超聲（功率250 W，頻率50 kHz，下同）處理60 min，放冷至室溫，加70%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取木通對(duì)照藥材0.05 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液，同法制備川木通、關(guān)木通、甘木通對(duì)照藥材溶液，即偽品對(duì)照藥材溶液。按龍膽瀉肝丸處方和工藝制備缺木通的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、偽品對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液圖譜中，出現(xiàn)與木通對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰，質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度較高。陰性對(duì)照品溶液的圖譜中雖含有1個(gè)與對(duì)照品溶液保留時(shí)間相似的色譜峰，但質(zhì)譜響應(yīng)很弱。提取陰性對(duì)照品溶液的相應(yīng)離子對(duì)發(fā)現(xiàn)，定量離子對(duì)m/z477→161的峰面積可忽略不計(jì)，定性離子對(duì)m/z477→315無與木通苯乙醇苷B保留時(shí)間一致的色譜峰，且通過子離子掃描發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照品溶液與對(duì)照品溶液圖譜的一、二級(jí)質(zhì)譜不一致，表明陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無干擾，專屬性良好。另外對(duì)川木通、關(guān)木通、甘木通對(duì)照藥材溶液進(jìn)行分析，其色譜圖中均未出現(xiàn)與對(duì)照品溶液圖譜保留時(shí)間一致的色譜峰［12-13］。詳見圖1。

圖1 總離子流圖1.Calccorioside BA.Reference solution B.Akebiae Caulis reference solution C.Test solution D.Negative reference solution E.Aristolochiae Caulis medicinal solutionF.Clematidis Armandii Caulis medicinal solution G.Clematidis Filamentosae Folium medicinal solutionFig.1 Total ion chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.4，1.0，2.0，4.0，10.0 mL，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取10 μL，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=29 941X-227.86（r=0.999 9）。結(jié)果表明，木通苯乙醇苷B質(zhì)量濃度在0.103 4～5.170 0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄離子豐度。結(jié)果木通苯乙醇苷B峰面積的RSD為2.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子豐度。結(jié)果，木通苯乙醇苷B峰面積的RSD為3.56%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品（批號(hào)13200607）適量，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子豐度并計(jì)算含量。結(jié)果木通苯乙醇苷B含量平均值的RSD為3.89%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（批號(hào)13200607）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的木通苯乙醇苷B對(duì)照品溶液適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子豐度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取36批樣品各適量，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄離子豐度并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表1。36批樣品均含有木通苯乙醇苷B，含量為14.42～255.02 μg/g。為了解企業(yè)間樣品中木通苯乙醇苷B含量的差異情況，對(duì)同一企業(yè)的不同批次樣品的含量取平均值，結(jié)果見圖2?？梢?，不同企業(yè)的樣品含量差異顯著，推測(cè)各企業(yè)所采購(gòu)的樣品中木通原料質(zhì)量差異較大。

圖2 各企業(yè)樣品中木通苯乙醇苷B平均含量分布圖Fig.2 Distribution of average content of calceorioside B in samples from different enterprises

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中流動(dòng)相考察了甲醇-0.02%氨溶液、乙腈-0.02%氨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液4個(gè)系統(tǒng)，通過比較離子豐度、目標(biāo)化合物色譜峰形和儀器耐用性等因素，選擇了乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）作為流動(dòng)相；質(zhì)譜參數(shù)方面選擇了較穩(wěn)定的MRM模式進(jìn)行定量分析，且在負(fù)離子模式下，木通苯乙醇苷B的離子豐度較高且穩(wěn)定。

木通苯乙醇苷B易溶于70%甲醇［14］，故以70%甲醇為提取溶劑，采用超聲提取，比較超聲30，40，50，60，70 min結(jié)果，發(fā)現(xiàn)超聲50 min后，木通苯乙醇苷B成分即提取完全，考慮方法的可靠性，最終選擇加入70%甲醇超聲60 min作為提取方法。為排除假陽性成分對(duì)含量測(cè)定的干擾，對(duì)所有市售樣品和木通對(duì)照藥材溶液進(jìn)行了子離子掃描，其主要子離子均為477，315，179，161，135，101，89，與木通苯乙醇苷B對(duì)照品的碎片離子基本一致，且通過計(jì)算MRM模式下的離子豐度可知，其結(jié)果均在對(duì)照品的離子豐度誤差范圍內(nèi)，而在陰性對(duì)照品和偽品對(duì)照藥材中均未檢出，說明該含量測(cè)定方法可行。

本研究中采用UPLC-MS/MS法建立了水丸中木通的質(zhì)量控制方法，通過對(duì)木通苯乙醇苷B的含量分析可知，各企業(yè)樣品含量差異顯著，表明木通原料質(zhì)量穩(wěn)定性較低，有必要對(duì)龍膽瀉肝丸中木通苯乙醇苷B含量擬定限度值，此項(xiàng)工作有待進(jìn)一步研究。

考慮到有些不法商家可能會(huì)利用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不完善的監(jiān)管漏洞，在生產(chǎn)過程中以假亂真、以次充好、不投料［15-16］，故進(jìn)一步補(bǔ)充完善龍膽瀉肝丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、建立制劑中木通含量測(cè)定方法對(duì)于保障該制劑的安全性、有效性具有重要意義。