李雙祁，劉國峰，王亞惠，趙肅清

(1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.湖南菲勒生物技術(shù)有限公司，湖南 長沙 410205；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

靈芝(Ganoderma lucidum)又稱“瑞芝” “仙草”，是一種珍稀食藥兩用真菌，具有修復(fù)受損細(xì)胞、促進(jìn)角質(zhì)層更新、淡斑、美白、抗衰老、提高免疫力等功效[1]。靈芝含有多糖類、三萜類、氨基酸、多肽類、凝集素、甾醇類、生物堿、酶類、礦物元素等多種活性成分，其中，發(fā)揮生物活性的主要成分是靈芝多糖和三萜類化合物[1-6]。在中國靈芝用于中草藥護(hù)膚品和滋補(bǔ)品已有2000 多年的歷史[7]。靈芝在化妝品中的應(yīng)用形式主要是子實(shí)體水提物和醇提物，其主要應(yīng)用于抗衰老領(lǐng)域，但對其美白、抗炎、抗過敏、防輻射、抗菌、防凍等功效的研究較少[8]。

目前，化妝品中的美白功效成分主要有熊果苷、曲酸、煙酰胺、維生素C 及其衍生物等[9]，但這些原料存在穩(wěn)定性差、易過敏、生產(chǎn)成本高等問題[10]。隨著人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對日化產(chǎn)品溫和性的要求也不斷提高，化妝品原料天然化成為了發(fā)展趨勢[11]。靈芝作為中國的十大“仙草”之一，其美白功效越來越受到關(guān)注。有研究[8]報(bào)道，以靈芝子實(shí)體為培養(yǎng)基，以酵母菌和乳酸菌為發(fā)酵菌種，靈芝發(fā)酵液對酪氨酸酶活性抑制率高達(dá)73.22%。由于靈芝的野生資源日漸稀缺，子實(shí)體人工栽培周期長，價(jià)格因素影響了靈芝相關(guān)產(chǎn)品的大規(guī)模推廣；因此，基于液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝相關(guān)活性物質(zhì)已成為研究熱點(diǎn)。

前期研究中，張周美等[12]利用菌絲體深層發(fā)酵技術(shù)獲得了靈芝發(fā)酵液，經(jīng)檢測，證實(shí)其具有良好的美白效果。本研究中，以評價(jià)美白功效的酪氨酸酶抑制率為主要檢測指標(biāo)，探究靈芝液體深層發(fā)酵技術(shù)的最優(yōu)生產(chǎn)工藝，通過基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)對發(fā)酵液中的主要成分進(jìn)行分析，明確發(fā)酵液中的主要活性成分與美白功能之間的關(guān)系，旨在探討靈芝發(fā)酵液是否能作為低成本、純天然功效原料來替代傳統(tǒng)的靈芝子實(shí)體發(fā)酵液或提取液在化妝品中進(jìn)行應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試菌株A-1916 由江蘇高郵市科學(xué)食用菌研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯 20 g(去皮)，葡萄糖 2 g，瓊脂2 g，蒸餾水 1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

平板培養(yǎng)基：MEA 培養(yǎng)基，購自青島日水生物技術(shù)有限公司，115 ℃滅菌30 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽浸粉 2 g，葡萄糖 2 g，胰蛋白胨 0.1 g，酵母膏 0.1 g，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)

無菌條件下將菌株(1 cm×1 cm)轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，30 ℃避光培養(yǎng)5 d 后再轉(zhuǎn)接至平板培養(yǎng)基，30 ℃避光培養(yǎng)5 d。平板種子接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 避光振蕩培養(yǎng)6 d，9000 r/min離心30 min 后收集上清液并進(jìn)行代謝組分析，檢測多糖和三萜含量，計(jì)算酪氨酸酶抑制率。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

按表1 分別配置4 種培養(yǎng)基。100 mL 分裝，無菌條件下接種3 塊菌絲塊，30 ℃、160 r/min 避光振蕩培養(yǎng) 4 d，過濾。分別測定發(fā)酵液酪氨酸酶的抑制率。每種培養(yǎng)基重復(fù)3 次。

表1 供試培養(yǎng)基的配方Table 1 Different medium formulations

1.2.3 生長條件的優(yōu)化

以1.2.2 優(yōu)化后的培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別設(shè)置不同培養(yǎng)天數(shù)、溫度梯度和pH 梯度，于160 r/min 搖床避光振蕩培養(yǎng)，離心，過濾，測定發(fā)酵液酪氨酸酶的抑制率。

1.2.4 發(fā)酵液代謝組學(xué)的分析

1 mL 發(fā)酵液中加入甲醇配置的內(nèi)標(biāo)(含L-2-氯苯丙氨酸(0.3 mg/mL)、C-17(0.01 mg/mL))20 μL，凍干；用300 μL 的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇與乙腈的體積比為2∶1)復(fù)溶，渦旋30 s，在冰水浴中超聲提取5 min；低溫離心10 min(13 000 r/min，4 ℃)，用注射器吸取200 μL 的上清液，用0.22 μm 的有機(jī)相針式過濾器過濾后轉(zhuǎn)移至LC 進(jìn)樣小瓶，-80 ℃下保存，用于LC- MS 分析。

采用Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀進(jìn)行處理。色譜條件如下：色譜柱，ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱溫，45 ℃；流動(dòng)相，A 相，水(含0.1%甲酸)，B 相，乙腈(含0.1%甲酸)；流速，0.4 mL/min；進(jìn)樣體積，2 μL。采用正負(fù)離子掃描模式分別采集樣品質(zhì)譜信號。每10 個(gè)分析樣本中插入1 個(gè)質(zhì)控樣本，以考察整個(gè)分析過程的重復(fù)性。獲得原始數(shù)據(jù)后對數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息分析，對所有樣本的總離子流圖進(jìn)行可視化檢查。在模式識別之前進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件 progenesis QI 進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時(shí)間校正、峰對齊和歸一化后得到具有保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的代謝物鑒定數(shù)據(jù)矩陣。

1.2.5 酪氨酸酶抑制率測定方法

參照田春龍[13]的方法，按表2 配置4 組溶液。加入PBS(0.2 mol/L、pH 6.8)、酪氨酸酶(200 U/mL)、樣液后混勻，37 ℃恒溫水浴10 min 后分別加入1 mL 的L-酪氨酸(0.15 mmol/L)，在37 ℃下反應(yīng)10 min，最后在冰水中迅速冷卻，使用多功能酶標(biāo)儀測定475 nm 下4 組樣品的吸光值。按公式(1) 計(jì)算酪氨酸酶活性抑制率。

表2 酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)體系Table 2 Experimental system of tyrosinase inhibition

式中：K為酪氨酸酶活性抑制率；K1、K2、K3、K4分別為A1、A2、A3、A4溶液在475 nm 處的吸光度。

1.2.6 胞外多糖和三萜的提取與測定

胞外多糖通過3 倍體積的95%乙醇進(jìn)行醇析提取；采用苯酚硫酸法測定發(fā)酵液中多糖的含量；參照文獻(xiàn)[14]提取靈芝三萜；采用香草醛-高氯酸顯色法測定樣品的三萜含量[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、方差分析和相關(guān)性分析；采用SPSS 對不同處理?xiàng)l件下酪氨酸酶抑制率差異顯著性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用GraphPad Prism 9 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

從圖1-A 可以看出，麥芽浸粉培養(yǎng)基1 的發(fā)酵效果最佳，酪氨酸酶抑制率達(dá)83.54%，顯著高于其他3 種培養(yǎng)基的抑制率(P＜0.05)。采用優(yōu)化好的培養(yǎng)基1 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，結(jié)果 (圖1-B)表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，靈芝發(fā)酵液酪氨酸酶抑制率逐漸升高，在第6 天達(dá)到最高值(90%)。從圖1-C 可以看出，靈芝發(fā)酵液酪氨酸酶抑制率與溫度相關(guān)，在15～30 ℃，隨著溫度的升高，發(fā)酵液酪氨酸酶抑制率逐漸升高；在30 ℃時(shí)，酪氨酸酶抑制率最高，達(dá)94.21%；＞ 30～35 ℃，隨著溫度的進(jìn)一步升高，發(fā)酵液酪氨酸酶抑制率逐漸降低。此外，靈芝發(fā)酵液的酪氨酸酶抑制能力受初始pH 的影響較大，在適宜菌絲生長的范圍(pH 3～7)內(nèi)，其發(fā)酵液的酪氨酸酶抑制率相對較高；在pH 值為5 時(shí)，酪氨酸酶抑制率達(dá)最大值(95.1%)。

圖1 不同培養(yǎng)基配方、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵液初始pH 下靈芝發(fā)酵液的酪氨酸酶抑制率Fig.1 Tyrosinase inhi bition r ate o f G.lucidum fe rmentation br oth u nder diffe rent medium form ula, fe rmentation time, f ermentation temperature and initial pH

2.2 靈芝發(fā)酵液代謝組學(xué)分析

采用LC-ESI-Q-TOF 非靶向代謝組學(xué)方法對發(fā)酵液中主要活性成分進(jìn)行分析。通過數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定出212 種有功能注釋的活性成分。對這些活性成分進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)靈芝三萜種類有30種(表3)，靈芝多糖種類有26 種(表4)，核苷酸有12 種，氨基酸有13 種，其余的為其他活性成分。

表3 靈芝發(fā)酵液中鑒定的30 種三萜的基本性質(zhì)Table 3 Basic properties of 30 triterpenes identified in G.lucidum fermentation broth

表3(續(xù))

表4 靈芝發(fā)酵液中鑒定出的多糖的基本性質(zhì)Table 4 Basic properties of polysaccharides identified in G.lucidum fermentation broth

2.3 靈芝三萜、多糖含量與靈芝發(fā)酵液酪氨酸酶抑制作用的相關(guān)性分析

對發(fā)酵液中靈芝多糖和三萜含量及酪氨酸酶抑制率進(jìn)行測定。結(jié)果表明，發(fā)酵液中靈芝多糖含量為24.8 mg/g，三萜含量為55.7 μg/mL，多糖和三萜提取率分別為74.5%和75.9%。發(fā)酵液原液酪氨酸酶抑制率為95.1%；三萜類提取物的酪氨酸酶抑制率為69.87%，多糖提取物的酪氨酸酶抑制率為26.74%。說明發(fā)酵液中具有美白活性的成分主要為靈芝三萜。

對發(fā)酵液中靈芝多糖和三萜含量與酪氨酸酶抑制率的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2)表明，靈芝三萜對酪氨酸酶抑制率影響顯著，靈芝三萜含量與酪氨酸酶抑制率呈線性相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)R2=0.983 7，而多糖含量與酪氨酸酶抑制率之間沒有明顯的相關(guān)性。說明通過本工藝生產(chǎn)的靈芝菌絲體深層發(fā)酵液中的主要美白功能性物質(zhì)為三萜類化合物。

圖2 發(fā)酵液中靈芝三萜含量、多糖含量與酪氨酸酶抑制率的相關(guān)性Fig.2 Correlation a nalysis between G. luc idum triterpene a nd polysaccharide c ontent and t yrosinase inhi bition r ate in fermentation broth

3 結(jié)論和討論

本研究結(jié)果表明，具有美白活性的靈芝發(fā)酵液最佳培養(yǎng)條件為：麥芽浸粉2 g/mL，蔗糖1.72 g/mL，豆粕粉0.214 g/mL，酵母提取物0.1 mg/mL，pH 5，溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間6 d，轉(zhuǎn)速160 r/min。在此條件下，發(fā)酵液酪氨酸酶抑制率為95.1%。通過代謝組學(xué)技術(shù)鑒定出包括多糖、三萜、核苷酸和氨基酸等在內(nèi)的212 種成分，其中，多糖和三萜的種類最多，分別鑒定出26 種和30 種。發(fā)酵液三萜含量與酪氨酸酶抑制活性呈正相關(guān)，而多糖含量與酪氨酸酶抑制活性無明顯的相關(guān)性，表明發(fā)酵液中的主要美白因子為靈芝三萜。

現(xiàn)市面上常見的化妝品美白功能性原料可分為化學(xué)合成類和天然類。合成類美白劑能快速美白，但其自身所存在的安全性問題使其在化妝品中的使用受到極大限制[16]。由此，從天然產(chǎn)物中尋找安全高效的美白活性物質(zhì)已成為化妝品行業(yè)研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)成為美白化妝品的發(fā)展方向[17]。目前美白功效明確且應(yīng)用最多的天然產(chǎn)物來源包括人參、甘草、葛根、當(dāng)歸、川芎、靈芝等[18-20]。近年來，對以靈芝為基礎(chǔ)的化妝品原料研究和應(yīng)用相對較多。研究[21]發(fā)現(xiàn)靈芝菌中含有1 種黑色素降解酶，可以對合成的黑色素進(jìn)行降解。然而，靈芝生長需要數(shù)月乃至一年時(shí)間，同時(shí)病蟲害、栽培水平也大大制約著靈芝子實(shí)體的生產(chǎn)水平[22]。目前，靈芝深層發(fā)酵的研究主要集中在提高靈芝多糖、三萜產(chǎn)量及發(fā)酵液抗氧化特性方面，而對于其發(fā)酵液美白功效的研究卻相對較少。

目前從靈芝孢子粉和子實(shí)體分離得到的三萜類化合物有上百種[23]，但對菌絲體的三萜種類及其具有美白功能的關(guān)鍵成分研究相對較少。研究[24]結(jié)果表明，靈芝萜酮二醇可抑制黑色素的合成。但是靈芝發(fā)酵液中三萜類美白功能性成分尚少見報(bào)道。本研究中，通過代謝組學(xué)技術(shù)鑒定了包括多糖、三萜、核苷酸和氨基酸等在內(nèi)的212 種成分。其中，多糖和三萜的種類最多，進(jìn)一步證實(shí)了三萜類物質(zhì)為靈芝發(fā)酵液的主要美白成分。由于三萜類有30種，每種三萜的美白效果如何有待進(jìn)一步研究。