胡夢媛,李雅穎,葛超榮,張迎迎,姚槐應(yīng)

(1.武漢工程大學(xué) 武漢 430074;2.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所 廈門 361021)

氮素對于植物生長至關(guān)重要,據(jù)估計(jì),全球植物每年需要大約1.5 億至2 億t 礦物氮,其中大約1 億t氮是通過Haber-Bosch 工藝生產(chǎn)的。每生產(chǎn)1 kg 氮肥會產(chǎn)生3.6 kg CO2。除此之外,化肥過量施用導(dǎo)致土壤板結(jié)、土壤酸化并增加土壤氮素流失等諸多環(huán)境問題。生物固氮則能有效地避免這些問題,固氮菌可以將大氣氮轉(zhuǎn)化為植物可利用氮,且不會造成環(huán)境污染及氮素流失等問題[1]。據(jù)估計(jì)全球每年固定的活性氮量為(2.03±0.5)億t,其中約1/3 來自陸地生態(tài)系統(tǒng),2/3 來自海洋生態(tài)系統(tǒng)[2]。因此,生物固氮是生物圈總氮量的主要貢獻(xiàn)者之一。Herridge 等[3]關(guān)于不同生態(tài)系統(tǒng)生物固氮研究表明,目前全球農(nóng)作物、草地、森林系統(tǒng)的生物固氮量每年為0.5 億～0.7 億t,且農(nóng)業(yè)的生物固氮量接近工業(yè)化前的生物固氮量。雖然共生固氮單位固氮量高[150～300 kg(N)?hm?2],但其只存在于豆科(Leguminosae)植物中[4],而禾本科(Poaceae)植物的固氮作用往往依賴于非共生固氮,雖然其單位固氮量低[63～69 kg(N)?hm?2][5],但分布廣泛,在大多數(shù)糧食作物[如水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)和小麥(Tritieum aestivum)等]中均發(fā)現(xiàn)非共生固氮菌株。所以非共生固氮對總固氮量的貢獻(xiàn)(尤其是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中)也不容忽視,且其在減緩全球溫室氣體排放及農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)方面有重大潛力。

非共生固氮包括自生固氮和聯(lián)合固氮。自生固氮菌是指能在土壤中獨(dú)立進(jìn)行固氮的細(xì)菌,其分布廣、種類多,雖然單位固氮量低,但總固氮量高,藍(lán)藻(Cyanobacteria)、圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)等是土壤主要的自生固氮菌。聯(lián)合固氮主要存在于禾本科植物根際,與植物互惠互利,但其不與植物宿主形成特異分化組織[6]。它們主要依賴植物表面分泌物或定殖于植物體內(nèi)獲得能源,在氧濃度合適的微環(huán)境中固氮,并為植物提供氮素營養(yǎng)。

2050年,預(yù)計(jì)全球人口達(dá)100 億,而農(nóng)業(yè)產(chǎn)量需提高56%才能滿足人口對糧食的需求[7]。為避免大量施用化肥造成的環(huán)境問題,實(shí)現(xiàn)生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展,研究禾本科植物中聯(lián)合固氮菌的作用機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制對提高氮素固定量,減少肥料施用具有重要意義。本綜述主要以禾本科植物,如甘蔗(Saccharum officinarum)、水稻、玉米和小麥體系為例,在聯(lián)合固氮菌的種類及機(jī)理、固氮酶的活性與調(diào)控及固氮菌的資源與應(yīng)用方面進(jìn)行綜述,旨在為農(nóng)業(yè)氮管理提供指導(dǎo)意見,并且評估固氮菌在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用潛力。

1 聯(lián)合固氮菌的種類及固氮機(jī)理

1.1 聯(lián)合固氮菌的發(fā)現(xiàn)

1958年,D?bereiner 和Ruschel 從甘蔗根中分離出固氮菌拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia fluminensis),該研究證明禾本科植物中固氮菌的存在[8]。隨后研究者發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻也具有固氮的能力[9]。1975年D?bereiner等[10]在牧草及谷物的根系發(fā)現(xiàn)了固氮螺菌屬菌株(Azospirillumsp.),該菌株為兼性內(nèi)生菌,可在植物根際或根內(nèi)部定居。然而,在某些植物組織中也存在一些專性內(nèi)生菌。根據(jù)禾本科植物聯(lián)合固氮細(xì)菌的生理生態(tài)特征可將其大致分為:根際固氮菌和內(nèi)生固氮菌。根際固氮菌主要通過產(chǎn)生對宿主植物有益的植物激素等促生長因子而改變根系形態(tài)而促進(jìn)植物生長,主要包括雀稗固氮菌(Azotobacter paspali)、拜葉林克氏菌(Beijerinckiaspp.)等。內(nèi)生固氮菌又分為兩種:兼性內(nèi)生固氮菌和專性內(nèi)生固氮菌,兼性內(nèi)生固氮菌既能在根內(nèi)生長也可以定殖在根系表面和土壤中,主要的兼性內(nèi)生固氮菌為固氮螺菌屬的細(xì)菌,如產(chǎn)脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、亞馬遜固氮螺菌(Azospirillum amazomense)等。而專性內(nèi)生固氮菌在土壤中生存能力弱,甚至不能生存,它們主要存在于植物組織內(nèi)。這類細(xì)菌包括α-變形桿菌醋酸固氮菌(Acetobacter diazotrophicus)、β-變形桿菌固氮弧菌(Azoarusspp.)、織片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)、紅蒼白草螺菌(Herbaspirillum rubrisubalbicans)和伯克霍爾德菌(Burkholderiaspp.)等。這些細(xì)菌通過植物根表皮細(xì)胞或次生根形成處的細(xì)胞間隙感染植物,然后通過蒸騰作用經(jīng)木質(zhì)部擴(kuò)散到植物地上部分[11]。聯(lián)合固氮菌可以產(chǎn)生植物激素包括生長素(IAA)、類細(xì)胞分裂素(CTK)及類赤霉素(GA),從而影響植物根的呼吸速率和代謝,也能刺激根毛和次生根的形成,增加根毛和次生根數(shù)量。另外聯(lián)合固氮菌還可以增加宿主根的質(zhì)子流,從而刺激宿主植物對礦物質(zhì)的吸收,并提高三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中的有關(guān)酶的活性,從而增強(qiáng)植物根的抗病菌能力[12]。

1.2 聯(lián)合固氮菌在禾本科植物中的主要類群

甘蔗是一種多用途作物,主要用于生產(chǎn)糖、能源和生物乙醇。它的生長需要大量氮素,研究發(fā)現(xiàn),甘蔗中的固氮菌主要分布在甘蔗根部及根際,地上部分固氮菌分布較少。Lima 等[13]和Kruasuwan 等[14]發(fā)現(xiàn),甘蔗中的聯(lián)合固氮菌主要為變形菌門(Proteobacteria,97.23%)和厚壁菌門(Firmicutes,2.78%)。1988年研究人員在甘蔗根部發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生固氮菌醋酸桿菌(Acetobacter diazotrophicus),它們寄生在植物組織內(nèi)部,不會引起任何疾病癥狀。但這種細(xì)菌不能在土壤中自由生活,必須依賴植物提供的營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖[15]。

水稻是全球半數(shù)人口的主要糧食來源,其生產(chǎn)受氮肥限制,在生長季時(shí),水稻對施入氮的吸收率不足50%,大部分則以淋溶或氣體形式損失,不僅帶來嚴(yán)重的環(huán)境問題,也造成經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于水稻中固氮的研究較多為變形菌門、藍(lán)藻。其中α-變形菌門中的慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)是優(yōu)勢屬,厚壁菌門和放線菌門(Actinomycetes)的含量相對較少[16-18]。固氮菌主要在水稻根部固氮,在地上植物部分和葉子部分,固氮菌的固氮量較少[19]。除此之外,研究發(fā)現(xiàn)小麥根際固氮菌主要由變形菌門、疣粒菌門(Verrucomicrobia)和藍(lán)藻組成,在分蘗期,鐮孢菌科(Scytonemataceae)和紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)相對豐度高,揚(yáng)花階段,伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderiales)和慢生根瘤菌屬相對豐度更高。小麥的優(yōu)勢菌屬同樣為隸屬于α-變形菌門的慢生根瘤菌屬[20-21]。

玉米中的固氮菌不僅僅存在于玉米根際,還存在于氣生根粘液處[22]。Abadi 等[23]發(fā)現(xiàn),玉米葉圈也可以固氮,從玉米葉圈分離的242 株菌株中有31.82%菌株為固氮菌。這些固氮菌隸屬于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門(Bacteroidetes)4 個(gè)細(xì)菌門,其中短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)為優(yōu)勢種。泛菌屬(Pantoea)、微桿菌屬(Microbacterium)和不動桿菌屬(Acinetobacter)次之。其他的被鑒定出來的還有紅球菌屬(Rhodococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、桿菌屬(Brachybacterium)、棒形桿菌屬(Clavibacter)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)和金黃桿菌屬(Chryseobacterium)等。玉米葉圈內(nèi)存在大量不同種類的固氮細(xì)菌,可以為植物提供氮素營養(yǎng)。

目前對于禾本科作物中聯(lián)合固氮菌的研究還在進(jìn)一步探索,其在植物體內(nèi)的分布及群落組成不僅與農(nóng)作物種類有關(guān),作物不同生長期也會影響固氮菌的類型(表1)。固氮菌主要分布在植物根際、植物組織的表面或內(nèi)部等不同部位中,在根際和根的表面,固氮菌分布密度最大。當(dāng)它們定植于內(nèi)生組織時(shí),它們在根內(nèi)的比例會更高[24]。另一方面,高通量測序表明許多nifH基因序列不屬于已分離得到的菌種,說明目前對土壤中固氮菌的研究尚不深入,還需要更多地篩選土壤中固氮菌或者進(jìn)行宏基因組測序[25]。另外,在水稻和小麥等禾本科植物中均檢測到慢生根瘤菌,該菌株的聯(lián)合固氮作用會在下文詳細(xì)介紹。

表1 禾本科植物中聯(lián)合固氮菌種類Table 1 Species of associated nitrogen-fixing bacteria in grasses

1.3 聯(lián)合固氮菌的固氮機(jī)理

固氮基因簇的大小約為11～64 kb,包含合成固氮酶基因、電子傳遞鏈和氧保護(hù)機(jī)制等。迄今為止,已鑒定出4 種固氮酶,根據(jù)金屬離子的不同,分為鐵鉬固氮酶、釩鐵固氮酶、鐵鐵固氮酶以及新型固氮酶[30]。前3 種固氮酶的結(jié)構(gòu)蛋白和輔因子生物合成序列高度保守,但對氧極不穩(wěn)定[31]。其中nifH基因由于高保守型,通常用于鑒定固氮菌。釩鐵固氮酶和鐵鐵固氮酶是選擇性固氮酶,僅存在于少數(shù)的固氮菌中,選擇性固氮酶往往與鉬鐵固氮酶共存。3 種固氮酶中固氮效率最高的是鉬鐵固氮酶,其次是釩鐵固氮酶和鐵鐵固氮酶[32]。

鉬鐵固氮酶結(jié)構(gòu)蛋白由鉬鐵蛋白(固氮酶)和鐵蛋白(固氮酶還原酶)組成。鐵蛋白是由nifH基因編碼的γ2型同源二聚體。每個(gè)亞基之間有1 個(gè)單一的[Fe4-S4]簇連接。鉬鐵蛋白由1 個(gè)α2β2型的四聚體組成,由nifDK基因編碼。每個(gè)αβ 二聚體中包含兩個(gè)獨(dú)特的金屬簇:P 簇和M 簇。α- 和β- 亞基位于P 簇[Fe8S7]的界面上,底物在M 簇[MoFe7S9C-R-高檸檬酸](FeMo-co)處被還原。其中nifK基因編碼α 亞基,nifD基因編碼β 亞基。NifENXBQV 參與FeMo-co的合成以及嵌入;NifMWZ 參與鐵蛋白、鉬鐵蛋白的成熟;NifUS 參與Fe-S 簇的形成;nifJF基因編碼電子傳遞蛋白,nifJ基因編碼鐵氧還蛋白,nifF基因編碼黃氧還蛋白將電子傳遞給鉬鐵蛋白固氮酶進(jìn)行固氮反應(yīng)。在每個(gè)締合/解離步驟中,每個(gè)轉(zhuǎn)移的電子會水解兩個(gè)MgATP 分子[33-35]。具體構(gòu)造如圖1A。固氮過程為鐵蛋白與Mg-ATP 結(jié)合后,被黃素氧還蛋白或鐵氧還蛋白還原,并與鉬鐵蛋白暫時(shí)結(jié)合以傳遞電子。鐵蛋白每傳遞一個(gè)電子,同時(shí)伴隨兩個(gè)Mg-ATP 的水解。在這一催化反應(yīng)中,鐵蛋白反復(fù)氧化和還原,電子和質(zhì)子依次通過鐵蛋白和鉬鐵蛋白,最終傳遞給N2,使它們還原成NH3。

Thaweenut 等[36]通過15N2稀釋法測定甘蔗植株中聯(lián)合固氮菌的固氮作用,他們在甘蔗莖組織中檢測到nifH-mRNA,鑒定后發(fā)現(xiàn),表達(dá)該基因的主要聯(lián)合固氮菌的序列與慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)和固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)相似,這表明慢生根瘤菌屬可能是甘蔗中固氮的主要內(nèi)生固氮菌,該菌株主要在甘蔗莖組織細(xì)胞間質(zhì)外體定殖,可以通過同化甘蔗分泌的糖、有機(jī)酸和氨基酸等物質(zhì)來生長繁殖,并進(jìn)行氮的固定。

研究發(fā)現(xiàn)在水稻、小麥等作物中均存在較多的慢生根瘤菌。其在自由狀態(tài)下,可在富含碳源和能量源的質(zhì)外體的微氧環(huán)境下固定N2,形成類似于豆科植物根瘤共生體系統(tǒng)[37]。具體固氮方式見圖1B。1975年P(guān)agan 等[38]和Kurz 等[39]均發(fā)現(xiàn)某些根瘤菌,如慢生根瘤菌可以在自由生存狀態(tài)下表達(dá)固氮酶活性。自由固氮微生物,如克雷伯氏菌(Klebsiella),在貧瘠的環(huán)境中微量地固定N 為NH4+。而根瘤菌則相反,其必須在有特定的糖、有機(jī)酸和氮源(谷氨酰胺或氨或硝酸鹽)的存在下,才能將N2固定為NH4+,

并輸出體外。根瘤菌在微氧的條件下,N2的固定非?；钴S,且不受高濃度NH4+的抑制。但是會受到谷氨酰胺合成酶將固定的N(NH4+)同化為谷氨酰胺的作用的抑制,因?yàn)楣劝滨０泛铣擅赶佘挣；?并在低pH(5.3～5.6)條件下排泄到質(zhì)外體中,質(zhì)外體中的氨可能被植物細(xì)胞吸收同化[40]。

Greetatorn 等[41]最近研究了慢生根瘤菌SUTN9-2(Bradyrhizobiumsp.SUTN9-2)菌株在水稻中形成內(nèi)生組織的固氮機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn),加入水稻提取物后,慢生根瘤菌SUTN9-2 的細(xì)胞增大,DNA 含量增加,從而增加了該固氮菌的固氮量?？赡艿脑蚴撬咎崛∥镏械哪承┮蛩卣T導(dǎo)了細(xì)胞增大和固氮基因的表達(dá)。從轉(zhuǎn)錄組分析差異表達(dá)基因(DEGs)可知,SUTN9-2 受水稻提取物和bclA基因缺失的影響。上調(diào)的DEGs 編碼一類氧化還原酶,它們與氧原子作用,猜測該基因可以調(diào)控固氮酶固氮時(shí)的氧含量,之后是固氮酶功能所需的GroESL 伴侶蛋白。這些結(jié)果表明,SUTN9-2 在水稻提取物中,固氮作用是由GroESL 伴侶蛋白和氧化還原酶的集體效應(yīng)引起的。即使bclA發(fā)生突變,抗微生物肽轉(zhuǎn)運(yùn)體(antimicrobial peptide transporter,sapDF)的敏感性表達(dá)也會被上調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞分化。這一結(jié)果表明,水稻產(chǎn)生的防御素類抗菌肽(DEFs)與豆科植物產(chǎn)生的根瘤特異性富半胱氨酸(NCR)肽相似,這影響了細(xì)菌細(xì)胞的分化。

2 聯(lián)合固氮菌的活性和調(diào)控

提高聯(lián)合固氮菌在禾本科植物中的固氮率,不僅能改善土壤因大量施入化肥造成的環(huán)境問題,還對提高土壤抗病菌能力、土壤肥力具有重要意義。因此,了解影響聯(lián)合固氮菌的環(huán)境因素,通過改善農(nóng)藝管理措施來提高聯(lián)合固氮菌固氮活性,可為植物提供更多的氮素營養(yǎng)。固氮是一個(gè)極度耗能的過程,需要消耗大量的碳源、氮源,因此環(huán)境中營養(yǎng)元素的含量對于聯(lián)合固氮菌固氮具有重要作用。

2.1 施加碳源

由于大量化肥施用造成了土壤板結(jié)、酸化、生物多樣性降低等問題,因此,為緩解因?yàn)榛适┘舆^量造成的環(huán)境問題,有機(jī)物添加是改善土壤環(huán)境的有效選擇。施加秸稈、生物炭、根系分泌物以及糞肥等可以提升土壤養(yǎng)分,為土壤中微生物提供碳源,從而改善土壤環(huán)境,提高土壤綜合能力,是增加土壤碳源的重要方式,而添加有機(jī)碳也可以為固氮菌提供能量。

Liu 等[42]發(fā)現(xiàn)nifH基因豐度與土壤有機(jī)碳呈正相關(guān),他們將生物炭和小麥秸稈施加至堿性土壤中,發(fā)現(xiàn)生物炭的添加增加了土壤中聯(lián)合固氮菌的nifH基因豐度,添加秸稈和生物炭均增加了土壤固氮速率,但相比較而言,施加生物炭處理組的固氮速率更高,最高可升高52.73%左右;施加秸稈固氮速率僅增加8.5%左右;進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)施加生物炭不僅增加了土壤中有機(jī)碳含量,還增加了土壤中有效磷的含量。Hu 等[43]在中性黑土中施用35年肥料,發(fā)現(xiàn)僅施加糞肥顯著增加了nifH基因豐度,而全部施加化肥和施加部分糞肥的土壤中,nifH基因豐度比對照土壤顯著降低,且土壤中主要的聯(lián)合固氮菌為α-變形菌。

2.2 施加氮素營養(yǎng)

大量研究認(rèn)為,過度施用無機(jī)氮肥會降低土壤微生物的固氮活性,長期氮肥施用會改變土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu),導(dǎo)致聯(lián)合固氮菌多樣性降低[44-46]。其主要原因是當(dāng)環(huán)境中存在可利用氮時(shí),固氮菌的固氮作用被抑制,且不需要自身固氮來維持所需氮源。Wang 等[47]在酸性玉米農(nóng)田土壤中施無機(jī)肥25年后,發(fā)現(xiàn)施氮和施氮磷鉀處理的土壤中nifH基因拷貝數(shù)均顯著降低,而施加磷鉀處理的玉米生物量和nifH拷貝數(shù)顯著增加;但施加生石灰可以有效緩解氮肥的抑制作用。說明施加氮肥會導(dǎo)致土壤pH 降低,土壤酸化對聯(lián)合固氮菌的影響較大。但也有試驗(yàn)表明,添加少量化肥或化肥與有機(jī)肥配合施用,可提高土壤中nifH基因豐度,并增加氮素利用率,減少氮素流失[45-46]。當(dāng)環(huán)境中施用少量氮肥時(shí),氮素可以促進(jìn)固氮菌生長,從而增加固氮菌含量及多樣性并增加固氮活性。Wang 等[48]通過研究施肥量對長期稻田土壤固氮微生物的影響表明,固氮菌多樣性隨著長期施肥而增加,但隨著施肥量的增加而逐漸減少,氮磷鉀肥(NPK)處理的固氮菌多樣性最高,3 倍NPK 處理的土壤中固氮菌多樣性與對照無顯著差異。Pereira 等[49]研究氮肥和聯(lián)合固氮菌的施加對甘蔗莖、糖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)的影響,發(fā)現(xiàn)施加低劑量(50 kg?hm?2)氮肥和聯(lián)合固氮菌的甘蔗產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益最高。Zhou 等[50]研究長期施肥對小麥聯(lián)合固氮菌群的影響,發(fā)現(xiàn)加入低劑量氮肥沒有降低小麥聯(lián)合固氮菌的多樣性,但高劑量氮肥輸入導(dǎo)致聯(lián)合固氮菌的多樣性降低。因此氮肥的添加并不完全抑制固氮菌固氮作用。但毫無疑問,過量氮肥的施入一定會造成大量氮損失,并且減少固氮菌多樣性,因此考慮適量氮肥與生物肥的配施,或許能更好地提高固氮效果。

2.3 施加其他礦物元素

鉬是固氮酶中心元素,在土壤中適當(dāng)添加鉬可有效增加聯(lián)合固氮菌固氮量。2008年Barron 等[51]發(fā)現(xiàn)微量元素鉬限制了巴拿馬低地森林土壤中固氮菌的固氮作用,他們發(fā)現(xiàn)在施用了含有鉬的磷肥后,該森林土壤的固氮作用急劇增加,而施加沒有鉬的磷肥,土壤中固氮作用增加較少。Ma 等[18]也發(fā)現(xiàn),在不施氮的條件下,施用鉬顯著提高了水稻土的固氮量,增加了nifH基因拷貝數(shù)和藍(lán)藻相對豐度。

磷的有效性經(jīng)常限制固氮菌的固氮作用,磷輸入可以滿足三磷酸腺苷合成和固氮酶蛋白的磷需求,從而改善固氮菌群[52-53]。在土壤中,只有0.1%的總磷供植物吸收。因此有效磷的添加對聯(lián)合固氮菌固氮有重要意義。Xiao 等[54]在喀斯特草地進(jìn)行了養(yǎng)分添加試驗(yàn),即氮、磷和氮磷共添加,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合固氮菌多樣性和群落組成對磷的添加比對氮的添加更敏感,磷的加入顯著增加了固氮菌的豐富度、多樣性和群落組成,但固氮速率沒有明顯增加,磷可能具有喚醒休眠中某些聯(lián)合固氮菌的作用。Stanton 等[55]發(fā)現(xiàn),磷在抑制植物冠層中存在的藍(lán)藻總氮固定中起主要作用,而鉬在決定單個(gè)細(xì)胞的固定率方面發(fā)揮了次要作用。Li 等[56]將固氮菌和解磷菌共接種發(fā)現(xiàn),共接種顯著提高了植物生物量(長度、鮮重和干重)、含氮量和含磷量;與單獨(dú)接種固氮菌相比,共接種還顯著提高了土壤全氮、速效磷和固氮酶活性,共接種使nifH基因在芽和根中的表達(dá)加倍。有效磷的添加對固氮菌豐度、多樣性及固氮量的增加均有效。

除了鉬和磷外,有效鐵和鉀的應(yīng)用也至關(guān)重要。Thompson[57]研究發(fā)現(xiàn)固定氮的Fe-N2催化劑可以質(zhì)子化形成中性的Fe(NNH2)中間體,在進(jìn)一步質(zhì)子化后,該中間體雜化分裂N-N 鍵,釋放[FeIV≡N]+和NH3,該試驗(yàn)證明鐵對生物固氮的重要意義。Trovero 等[58]發(fā)現(xiàn)在缺鐵時(shí),固氮菌Herbaspirillum seropedicaeZ67失去了固氮能力。Ma 等[19]通過15N2標(biāo)記的方法發(fā)現(xiàn),在土壤中種植水稻會增加固氮量,可能是由于水稻種植吸收了土壤中的氨態(tài)氮,降低了土壤氮含量,且水稻種植的土壤中有效鐵(Fe2+)含量高于休耕土壤,這些變化有利于生物固氮;此外,還發(fā)現(xiàn)根部的固氮量高于地上部植物部分和葉子部分。Alahari 等[59]發(fā)現(xiàn)鉀缺乏可導(dǎo)致多種代謝損傷,并導(dǎo)致絲狀、異囊性、固氮藍(lán)藻的停止生長。因此適當(dāng)添加鐵和鉀元素對固氮菌生長及固氮有重要作用。

3 聯(lián)合固氮菌的資源與應(yīng)用

為尋找可替代氮肥的生物肥料,研究者們將目光投至菌劑研發(fā)中,力求通過分離篩選高效固氮菌,大規(guī)模培養(yǎng)投入農(nóng)業(yè)中,以解決大量工業(yè)氮肥施加所造成的環(huán)境影響。然而,目前固氮菌的施加有很多未解決的問題,例如,固氮量不穩(wěn)定、成本高,與土著微生物間存在競爭[6];或者篩選的固氮菌可能是潛在致病菌等。目前這些問題還沒有很好的解決方法,但研究者們?nèi)栽诓粩嗯Y選高效固氮菌,研究基因改造以及了解菌群協(xié)作方式等,以期望通過這些方式提高固氮菌在田間的固氮效率。

3.1 施加固氮菌增加固氮量

隨著生物固氮研究的深入,研究者篩選出的高效固氮菌種類繁多,并將其應(yīng)用于土壤及植物組織中進(jìn)行固氮的研究。Singh 等[60]從甘蔗根際分離出22 種生物防治能力及固氮能力強(qiáng)的固氮芽孢桿菌(Bacillus megaterium和Bacillus mycoides),并將它們接種至甘蔗中,發(fā)現(xiàn)這些菌種成功在甘蔗根際定殖,大部分位于根和葉中,且接種后甘蔗的固氮能力增加,還提高了甘蔗對病原體的耐受性,增強(qiáng)了甘蔗的生物防治。這些菌株在保護(hù)甘蔗、適應(yīng)環(huán)境壓力和提供養(yǎng)分方面發(fā)揮了重要作用,且該菌具有較厚細(xì)胞壁,對外界環(huán)境耐受能力較強(qiáng),更能適應(yīng)不同環(huán)境。狄義寧等[61]將分離出的內(nèi)生菌接種至不同基因型的甘蔗中,發(fā)現(xiàn)甘蔗的農(nóng)藝性狀及生理指標(biāo)均優(yōu)于未接種甘蔗。Song 等[62]研究發(fā)現(xiàn),在水稻田中接種固氮藍(lán)藻和施肥不僅增加氮肥利用效率,降低總?cè)芙獾牧苁?而且接種藍(lán)藻比單獨(dú)使用尿素在水稻種植后期有更大的氮素保持率,因?yàn)楣痰{(lán)藻具有攔截、修復(fù)和延遲釋放氮的特性。Banik 等[63]在水稻種植中接入內(nèi)生固氮菌[Azotobactersp.strainAvi2(MCC3432),AzA]后,發(fā)現(xiàn)無論在盆栽和大田試驗(yàn)中,AzA 替代一半化肥對水稻產(chǎn)量無顯著影響,說明該菌株可顯著減少氮肥用量。之前研究人員從小麥中分離出類芽孢桿菌Paenibacillus triticisoli,命名為BJ-18,該菌具有較強(qiáng)的固氮能力,可以固定氮素,并產(chǎn)生促生長激素、鐵載體和吲哚乙酸促進(jìn)植物生長,目前該菌株已被驗(yàn)證可以促進(jìn)玉米和小麥的生長[40,64-65]。

除了單一菌株接種外,Li 等[56]發(fā)現(xiàn)同時(shí)接種溶磷菌(Paenibacillussp.B1)和內(nèi)生固氮菌克雷伯氏桿菌(Klebsiellasp.)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)等,可顯著增加小麥產(chǎn)量以及nifH基因表達(dá)量,其聯(lián)合接種影響比單獨(dú)接種更顯著。試驗(yàn)人員在巴西接種巴西固氮螺菌菌株Ab-V5 和Ab-V6 到玉米和小麥種子中,發(fā)現(xiàn)與未接種對照相比,Ab-V5 和Ab-V6 使玉米平均增產(chǎn)27%,小麥平均增產(chǎn)31%;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ab-V5 和Ab-V6 菌株提高生產(chǎn)力的主要原因是植物激素的合成,促進(jìn)根系生長,增加水分和養(yǎng)分吸收,并提高了對非生物脅迫的耐受性[66]。Gómez-Godínez等[67]將分離到的具有固氮能力的幾種固氮菌接種至玉米植株中,發(fā)現(xiàn)接種固氮菌的玉米產(chǎn)量增加,固氮量增加,但加入混合固氮菌相比較加入單菌種固氮菌可以為玉米提供更多的氮素,說明接種的促植物生長的菌株之間存在著相互作用,猜測可能是其他細(xì)菌促進(jìn)固氮菌的固氮能力。Drogue 等[68]發(fā)現(xiàn)當(dāng)在水稻中接種固氮螺菌(Azospirillumspp.)菌株后并不表達(dá)nifH基因,但當(dāng)接入其他促生長菌后,該菌種的nifH基因表達(dá),并提高固氮量。

除了接種分離到的野生菌與通過菌群協(xié)作提高固氮量外,還可以通過基因改造的方式,解除固氮菌氮抑制,使菌劑中的固氮菌更容易在環(huán)境中存活,并提高固氮率。Bloch 等[69]通過識別和分離與關(guān)鍵作物密切相關(guān)的聯(lián)合固氮菌,然后通過基因編輯中斷連接氮敏感、固定和同化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),使該固氮菌的固氮能力、銨耐受性以及銨排出能力增強(qiáng)。該重組固氮菌與野生型固氮菌相比,其能在外源氮充足的環(huán)境中固氮,從而解除了野生型菌株的氮抑制作用。表2 總結(jié)了接種固氮菌對固氮酶活性和產(chǎn)量提高的作用效果。

表2 施加固氮菌對禾本科植物固氮酶活性或產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of nitrogen-fixing bacteria on nitrogenase activity or yield of Poaceae plants

3.2 固氮菌對土傳真菌病原體具有拮抗作用

研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物有病原菌入侵時(shí),植物根際會刻意招募某些特定的土壤微生物,從而改變土壤微生物群落,抑制土傳真菌病原體。類似的現(xiàn)象出現(xiàn)在不同地理區(qū)域的不同土壤中,表明疾病的抑制是通過相似機(jī)制發(fā)生的。一些研究表明,植物通過產(chǎn)生化合物來吸引一套有益微生物來應(yīng)對病原體的攻擊[70-71]。Yin 等[72]對小麥接種水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)AG8,發(fā)現(xiàn)在種植周期內(nèi),小麥根際的細(xì)菌群落與未侵染根際形成的菌群明顯不同;連續(xù)栽培和施用AG8 后,某些聯(lián)合固氮菌屬,包括固氮假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)等的相對豐度顯著增加。分離后發(fā)現(xiàn),這些菌屬均對該病原菌有拮抗作用。Zhou 等[73]篩選出幾株固氮藍(lán)藻菌株,發(fā)現(xiàn)其對水稻紋枯病控制效果顯著,最高可達(dá)54.5%;另外他們還發(fā)現(xiàn)固氮藍(lán)藻的加入可以有效地抑制番茄紅素和己二酸二異辛酯的分泌,還可以產(chǎn)生水楊酸、生長素和細(xì)胞因子等植物激素促進(jìn)植物生長,誘導(dǎo)植物抗病,并改善土壤養(yǎng)分含量以支持植物生長。綜上所述,這些研究結(jié)果表明植物中的微生物群落與病原菌侵染之間存在著密切的聯(lián)系,植物通過招募特定微生物以應(yīng)對病原菌侵染。而聯(lián)合固氮菌通常具有抗病抗逆能力,在固氮的同時(shí)能為植物提供更安全的生長環(huán)境。植物激素平衡的調(diào)節(jié)是促進(jìn)植物根系結(jié)構(gòu)改變和吸收更多營養(yǎng)的最重要的機(jī)制[56-57],固氮菌的加入有利于植物根系激素調(diào)節(jié),從而促進(jìn)植物更健康生長。

不同理化性質(zhì)或不同地點(diǎn)的土壤中固氮菌種類的不同或許和該土壤中不同菌群協(xié)作方式有關(guān),今后對于菌群分布的研究或許能更進(jìn)一步為土壤改善以及谷物增產(chǎn)提供指導(dǎo)性的建議。固氮菌的接種不僅可以提高植物固氮量,還可以提高產(chǎn)量,可促進(jìn)植物生長提高植物抗逆性。其促進(jìn)機(jī)制主要有:1)直接促進(jìn)。通過菌株的固氮、溶磷、解鉀和鐵螯合作用,提高土壤中植物可利用氮、磷、鉀、鐵元素;還可以分泌生長素(IAA)、赤霉素(GA)和細(xì)胞分裂素(CTK)等植物激素促進(jìn)植物生長。2)間接促進(jìn)。通過改善植物光合作用,調(diào)節(jié)植物體酶的活性,與病原菌競爭營養(yǎng)和空間來抑制病原菌,從而提高植物抗病能力。

3.3 固氮菌可能是潛在的人類病原菌

目前,大多數(shù)固氮菌還處于未培養(yǎng)或未分離的狀態(tài),分離出來的固氮菌中,大多數(shù)為促生長細(xì)菌,但也有研究表明,從谷物中分離的聯(lián)合固氮菌中,有人類病原體或潛在的人類病原體[74],如洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)等[75-77]。洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合體包括17 種,其中一些可導(dǎo)致免疫受損或囊性纖維化患者的致命肺部感染,另一些是動植物感染的病原體[77]。這種復(fù)合體通常定居于根際,并具有促進(jìn)植物生長的特性[78-80]?？死撞暇菑膸追N不同的植物中分離出來的。K.variicola342 具有參與處理植物源纖維素和芳香族化合物的基因,可用于將效應(yīng)蛋白分泌到真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,促進(jìn)真核細(xì)胞的感染,但沒有編碼效應(yīng)蛋白的基因,它對抗生素具有抗藥性。然而在小鼠身上進(jìn)行的致病性測試實(shí)驗(yàn)中,肺炎克雷伯氏菌342 與臨床分離株C3091 一樣還會引起尿路感染,但肺部感染的水平比較低[81]。

另一方面,其他與植物相關(guān)的細(xì)菌,如固氮螺菌、草本菌(Herbaspirillum)、重氮葡萄糖乙酰桿菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、固氮菌(Azoarcus)、固氮藍(lán)藻等被認(rèn)為是安全的[82-85],它們被用作農(nóng)業(yè)中的接種劑,且固氮藍(lán)藻的施加不僅可以固氮,還可以降低土壤中氮素流失率[65,86]。大量研究人員開展了固氮菌接種試驗(yàn),并發(fā)現(xiàn)固氮菌的接種成功提高了植物的固氮作用,并有效地提高植物的抗病抗逆能力。因此,篩選和應(yīng)用合適而安全的固氮菌對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要,某些對植物有益的固氮菌或許是潛在的人類致病菌,菌種安全問題也需要進(jìn)一步探索。

距第一個(gè)固氮菌的分離已有一百多年歷史了,但到現(xiàn)在為止,高效的促生長固氮菌的篩選仍然是研究的熱點(diǎn),篩選出可高效固氮、溶磷解鉀的固氮菌對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)仍有巨大的吸引力。目前為止,可培養(yǎng)的聯(lián)合固氮菌還很少,高效促生長固氮菌的分離和篩選,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境生態(tài)息息相關(guān),固氮菌的應(yīng)用對生態(tài)可持續(xù)發(fā)展有重要的意義。

4 結(jié)論

本文從禾本科植物的聯(lián)合固氮菌種類及其作用機(jī)理、固氮活性及調(diào)控方式以及聯(lián)合固氮菌的資源及應(yīng)用3 個(gè)方面進(jìn)行綜述,通過介紹禾本科植物聯(lián)合固氮菌的種類及作用機(jī)理,了解聯(lián)合固氮菌的作用方式,發(fā)現(xiàn)對聯(lián)合固氮菌的種類和作用機(jī)理研究還在不斷深入,但因?yàn)槁?lián)合固氮菌很容易受到環(huán)境因素的影響,如土著微生物競爭以及環(huán)境中營養(yǎng)元素變化等問題,因此相較共生固氮而言,其研究難度更大。另外目前還有很多未鑒別的聯(lián)合固氮菌,尤其水稻中的未分類固氮菌占比最大,因此今后還需要通過分離篩選和宏基因組測序等手段,認(rèn)識更多聯(lián)合固氮菌種類,提供聯(lián)合固氮菌的研究材料,更好地推動聯(lián)合固氮菌的發(fā)展。在固氮活性及調(diào)控方式方面,本文綜述了目前可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活中的調(diào)控措施,總的來說碳、氮、磷、鉀、鉬和鐵等均對固氮菌有較大的影響,適量添加可有效促進(jìn)固氮菌的固氮效率,但其具體施用量以及元素間精確配比仍然不清楚,今后需要加大對該方面的研究,提出切實(shí)有效的農(nóng)藝改良措施。固氮菌不僅可以改變菌群,提高土壤中固氮量,還能增加植物抗病抗逆能力。然而,其提供的氮量相對于植物生長所需氮量仍然不夠,且生物固氮受環(huán)境因素影響很大,其固氮量不穩(wěn)定等問題還需要進(jìn)一步研究解決。

5 展望

1)農(nóng)藝管理與調(diào)控。目前關(guān)于營養(yǎng)元素對土壤固氮菌的影響已經(jīng)有很多的研究,但不同研究中,營養(yǎng)元素的添加起到的效果不同,這與土壤性質(zhì)、環(huán)境因素等有關(guān)。因此,今后還需要多開展大尺度試驗(yàn),了解不同地區(qū)不同土壤性質(zhì)對固氮菌的影響,構(gòu)建擬合模型,了解最關(guān)鍵影響因素,為農(nóng)業(yè)管理措施提供更精準(zhǔn)的指導(dǎo)意見。2)菌劑應(yīng)用。目前研究發(fā)現(xiàn),與不添加固氮菌相比,添加固氮菌僅能少量增加土壤中固氮酶活性及作物產(chǎn)量。雖然在田間施加固氮菌能有效增加土壤固氮率和氮素留存量,但施加固氮菌對作物的生長仍然沒有直接施加尿素等化肥的效果明顯。因此,篩選高效固氮菌,探究固氮菌的施用方式及其影響因素是目前亟待解決的問題。聯(lián)合固氮菌的菌群協(xié)作、基因改造以及肥料配施均能有效增加植物氮素利用率,在這一方面研究人員還需進(jìn)一步定量分析,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供指導(dǎo)意見;另一方面,對于高效固氮菌的篩選還需要關(guān)注其安全性問題,要篩選出既能促進(jìn)植物生長,又對人類無害的聯(lián)合固氮菌。