夏博園李艷丁旭李鑫劉歆嬋于維先，3

1.吉林大學口腔醫(yī)院牙周病科，長春130021；

2.吉林大學口腔醫(yī)院老年口腔科，長春130021；

3.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，長春130021

牙周炎是牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）感染為主，以牙周結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收為特點的慢性炎癥性疾病，是全身系統(tǒng)疾病的危險因素之一[1]。越來越多的證據(jù)[2-3]表明，牙周炎與肝損傷如非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD），肝硬化及肝癌等疾病密切相關，但具體機制尚未明確。

近年來研究[4]表明，牙周炎患者的牙周組織、血清、齦溝液及唾液中氧化應激標志物顯著升高，抗氧化物水平明顯下調(diào)，提示氧化應激損傷在牙周軟硬組織破壞中發(fā)揮了重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）是一種共激活轉(zhuǎn)錄因子，其與下游的關鍵抗氧化蛋白核因子E2-相關因子2（nuclear factor ery‐throid 2-related factor 2，Nrf2）及線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）可增加細胞內(nèi)線粒體生物合成能力和降低細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平維持體內(nèi)抗氧化-氧化系統(tǒng)平衡[5-7]，進而緩解肝組織損傷[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，牙周炎大鼠牙齦組織中氧化應激水平升高，同時伴有P gc-1α、Nrf2和Tf am的基因表達水平顯著下調(diào)，因此本研究通過體內(nèi)實驗初步探究PGC-1α及其下游蛋白在牙周炎誘發(fā)肝損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

8周齡清潔級Wistar雄性大鼠（購于吉林大學實驗動物中心）；P.gingivalis標準菌株ATCC33277（首都醫(yī)科大學贈送）；正畸結(jié)扎絲（直徑0.2 mm）；卡那霉素、水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cel‐lulose，CMC-Na）、3,3-二氨基苯聯(lián)胺（diamino‐benzidine，DAB）顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol試劑（Ambition公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Prime-ScriptTM實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本），引物由TaKaRa公司設計合成；PGC-1α抗體（Abcam公司，美國）；兔鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（streptavidin-pe‐rosidase，SP）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantita‐tive real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（Thermo公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠牙周炎模型 24只雄性Wistar大鼠（200～220 g）隨機分為2組（n=12），實驗前飼喂卡那霉素水溶液（1 g·L-1）4 d，3 d后建立大鼠牙周炎模型。牙周炎組：10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉下結(jié)扎絲結(jié)扎大鼠右側(cè)上頜第一磨牙，將100μLP.gingivalis（濃度為1×109CFU·mL-1）懸浮于CMCNa中并接種于大鼠第一磨牙齦溝內(nèi)，每隔1 d接種1次，每周3次，根據(jù)前期研究建模6周[10]。對照組以等體積2%CMC-Na接種于相同部位。6周后10%水合氯醛麻醉下處死大鼠，取其肝組織進行后續(xù)實驗。

1.2.2 牙周檢查 肉眼觀察各組大鼠右側(cè)上頜第一磨牙牙齦情況，檢查牙周探診深度（probing depth，PD）、牙齒松動度（tooth mobility，TM）、齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）。用牙周探針測量大鼠右側(cè)上頜第一磨牙頰腭側(cè)近中、正中及遠中牙周袋底或齦溝底至齦緣的距離，取其平均值以記錄PD。用鑷子檢查第一磨牙頰腭、近遠中及垂直方向是否松動以記錄TM，TM評價標準：＜Ⅰ度，生理活動度；Ⅰ度，僅頰腭方向松動；Ⅱ度，頰腭及近遠中方向松動；Ⅲ度，頰腭、近遠中及垂直方向均松動。牙周探針檢查牙齦出血情況，根據(jù)Mazza法記錄SBI，計分標準如下：牙齦健康為0；牙齦輕度水腫，探診未出血為1；探診后呈點狀出血為2；探診出血沿齦緣擴展為3；出血溢出齦溝為4；自動出血或有潰瘍?yōu)?。

1.2.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 取部分肝組織置于10%中性甲醛固定液中24～48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（3μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，顯蘭液返藍，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 qRT-PCR 取部分肝組織于液氮下研磨，Trizol試劑提取肝組織總RNA。根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）。使用SYBR Prime-ScriptTMRT-PCR試劑盒，以cDNA為模板，β肌動蛋白為內(nèi)參，檢測P gc-1α、Nrf2、T fam基因表達，引物序列見表1。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火30 s，循環(huán)數(shù)為40。每個樣本設3個復孔，取平均值，2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物Tab 1 Primer sequence used for qRT-PCR

1.2.5 免疫組織化學檢測 使用免疫組織化學檢測肝組織中PGC-1α蛋白表達水平。石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，磷酸緩沖鹽溶液（phos‐phate buffer saline，PBS）沖洗，抗原修復，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，PBS沖洗，滴加封閉劑室溫孵育10 min，傾去封閉劑勿洗，滴加一抗PGC-1α（1∶200稀釋），4℃過夜。PBS沖洗，加生物素標記山羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）G聚合物室溫孵育10 min，PBS沖洗，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育10 min，PBS沖洗，DAB顯色（鏡下觀察），流水沖洗終止反應，蘇木素復染、脫水、透明、封片，光學顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用xˉ±s表示，采用t檢驗統(tǒng)計方法分析組間差異，TM及SBI采用曼-惠特尼U檢驗分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 建立大鼠牙周炎模型

本研究通過結(jié)扎絲結(jié)扎聯(lián)合齦溝內(nèi)接種P.gingivalis法成功建立大鼠牙周炎模型，見圖1，箭頭所示牙周炎組中大鼠的右上頜第一磨牙牙齦紅腫，質(zhì)地軟；對照組中大鼠第一磨牙牙齦呈粉紅色，齦緣菲薄，質(zhì)地韌。

圖1 大鼠牙周組織情況Fig 1 Periodontal condition of rats

2.2 牙周檢查結(jié)果

檢查各組牙周臨床指標，牙周炎組可探及不同深度的牙周袋，牙齒有不同程度松動，探診出血，對照組未見異常，見表2。

表2 牙周臨床指標Tab 2 Periodontal clinical indexes

2.3 HE染色結(jié)果

光學顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況，見圖2，箭頭所示牙周炎組大鼠肝組織中肝索排列紊亂，肝組織細胞見空泡性變，細胞間見大量炎癥細胞浸潤。相反，對照組大鼠肝組織中肝索排列整齊，肝組織細胞未見明顯異常。

圖2 大鼠肝組織HE染色Fig 2 The HE staining of liver tissues in rats

2.4 qRT-PCR結(jié)果

與對照組相比，牙周炎組P gc-1α、Nr f2及T fam的mRNA表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 大鼠肝組織Pgc-1α、Nrf 2及T fam的mRNA表達情況Tab 3 The mRNA expression of P gc-1α,Nr f2 and T fam in liver tissues of rats

2.5 免疫組織化學檢測結(jié)果

免疫組織化學檢測結(jié)果見圖3，大鼠肝組織細胞中棕黃色顆粒表示PGC-1α蛋白呈陽性表達，箭頭所示對照組PGC-1α廣泛分布于肝組織細胞的胞漿中，而牙周炎組中僅有個別肝組織細胞胞漿呈陽性，大部分肝細胞呈陰性。因此，牙周炎組中大鼠肝組織PGC-1α蛋白表達水平較對照組明顯降低。

圖3 大鼠肝組織免疫組織化學檢測結(jié)果Fig 3 The results of immunohistochemistry detection of liver tissues in rats

3 討論

研究[11]表明：P.gingivalis可引起口腔局部微生態(tài)紊亂，通過直接轉(zhuǎn)移定植進入血液循環(huán)系統(tǒng)或間接激發(fā)全身炎癥反應影響機體健康。Costa等[12]在臨床調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者的牙周炎發(fā)病率高達62.2%；其次，在NAFLD患者的肝組織活檢標本中可檢測到P.gingivalis，此外P.gingivalis可加劇高脂飲食誘導小鼠脂肪性肝炎的進程[13]。進一步研究[14]表明，高脂飲食誘導的大鼠牙周炎模型其肝組織出現(xiàn)炎癥細胞浸潤、纖維化、肝小葉變性及局部壞死等病理表現(xiàn)；本課題組前期研究[15]顯示，炎癥介質(zhì)Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子κB等參與結(jié)扎誘導大鼠牙周炎伴肝損傷的過程，而肝損傷可進一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝癌等[16]，極大影響生命健康。

為了更好地研究牙周炎與肝損傷之間的關系，本研究采用結(jié)扎聯(lián)合P.gingivalis齦溝內(nèi)接種法構(gòu)建大鼠牙周炎模型，組織學方法檢測大鼠肝組織可見肝細胞內(nèi)大量空泡性變，并伴有炎癥細胞浸潤。另外Dos Santos Carvalho等[17]發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎誘導的大鼠牙周炎相比對照組其肝組織中氧化應激產(chǎn)物丙二醛表達水平明顯升高，抗氧化產(chǎn)物谷胱甘肽表達水平顯著降低，肝組織出現(xiàn)脂肪性變。研究[18]證實，在牙周組織炎癥狀態(tài)下，主要由中性粒細胞過量產(chǎn)生的ROS引起氧化應激反應，造成組織損傷；而線粒體是細胞中ROS的主要來源和直接作用靶點[19]。Vasconcelos等[20]發(fā)現(xiàn)，牙周炎大鼠肝組織出現(xiàn)氧化損傷并伴有線粒體腫脹、破碎，由此推測氧化應激損傷可能在牙周炎誘發(fā)肝損傷中起重要作用。

PGC-1α是線粒體功能及生物合成的重要轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，也是清除線粒體中ROS的主要介質(zhì)[21]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)牙周炎大鼠肝組織中PGC-1α基因及蛋白表達水平與對照組相比顯著下降，其下游因子Nrf2、Tfam[6]的mRNA表達水平也明顯降低。研究[22]發(fā)現(xiàn)，牙周炎主要致病毒力因子P.gingivalis-LPS可誘發(fā)人牙齦成纖維細胞的線粒體功能障礙并明顯降低PGC-1α的蛋白表達水平。此外Singh等[23]研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis可顯著促進PGC-1α敲除小鼠脂肪細胞內(nèi)腫瘤壞死因子-α的表達水平，降低抗氧化酶錳超氧化物歧化酶的表達水平，從而加重細胞損傷。另外，Sánchez-Ramos等[24]體內(nèi)研究表明，高脂飲食誘導的小鼠脂肪肝模型中PGC-1α表達水平顯著下降。以上結(jié)果均提示，PGC-1α及其下游因子可能參與了牙周炎誘發(fā)大鼠肝損傷的過程。

本研究通過結(jié)扎聯(lián)合P.gingivalis齦溝內(nèi)接種法構(gòu)建大鼠牙周炎模型，初步認為牙周炎可誘發(fā)大鼠肝損傷，而PGC-1α及其下游因子可能參與牙周炎誘發(fā)大鼠肝損傷的過程，但其具體機制還有待進一步研究。期待為牙周炎誘發(fā)肝損傷的機制提供新思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。