賀玉姣 胡萬軍 都玉蓉 王 婷 杜 雷 胡書立

(1.青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西寧，810008；2.青海師范大學(xué)體育學(xué)院，西寧，810008)

高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)是一種小型哺乳動(dòng)物(Mammalia)，隸屬于兔形目(Lagomorpha)，鼠兔科(Ochotonidae)，鼠兔屬，主要生活在海拔3 000—5 100 m的高寒草原和高寒草甸，是青藏高原的優(yōu)勢種[1]。高原鼠兔一方面在維持青藏高原的生物多樣性、草原生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈的平衡等方面起到重要作用，被認(rèn)為是青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵種[2]。另一方面，在青藏高原的一些地區(qū)由于草地退化提高了嚙齒動(dòng)物(Rodentia)生境適合度，導(dǎo)致高原鼠兔種群密度過高，造成鼠害[3]。通過對高原鼠兔的種群遺傳分析有助于了解該物種的種群結(jié)構(gòu)，設(shè)立管理與保護(hù)單元，從而控制其種群數(shù)量[4]。而目前對高原鼠兔種群遺傳的分析大多是通過線粒體基因進(jìn)行的，基于核基因的相關(guān)分析則較少[5-6]。

SSR(simple sequence repeats)又稱微衛(wèi)星，是一類由幾個(gè)核苷酸(1—6 bp)組成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，廣泛分布于真核生物和部分原核生物的核基因中[7]。SSR標(biāo)記的高突變速率通常會(huì)產(chǎn)生高水平的多態(tài)性，同時(shí)它還具有進(jìn)化所受選擇壓力小、共顯性遺傳、易于分析、較好的重復(fù)性等特點(diǎn)，使其廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)等的研究中[8]。傳統(tǒng)的SSR篩選方法，如富集文庫篩選法，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，篩選效率往往較低[9]。Li等[10]通過磁珠富集法對高原鼠兔的SSR進(jìn)行分析僅得到13對引物。而隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，可以通過基因組、轉(zhuǎn)錄組等數(shù)據(jù)，對樣本的SSR進(jìn)行分析，得到大量SSR位點(diǎn)[11-13]。其中，簡化基因組測序技術(shù)(RAD-seq)利用限制性內(nèi)切酶對基因組 DNA 進(jìn)行酶切，并對酶切片段進(jìn)行高通量測序，該技術(shù)極大地降低了基因組的復(fù)雜度，不受參考基因組的限制，且測序成本低、準(zhǔn)確率高[14]，用此方法已經(jīng)在大刺鰍(Mastacembelusarmatus)、印尼虎魚(Datnioidespulcher)等動(dòng)物中開發(fā)出SSR標(biāo)記并應(yīng)用于遺傳研究[15-16]。本研究采用RAD-seq技術(shù)對高原鼠兔的SSR信息進(jìn)行分析，并進(jìn)行SSR引物的開發(fā)，為基于SSR分子標(biāo)記開展的遺傳多樣性、種群遺傳分析等研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本與基因組DNA的提取

試驗(yàn)所用8個(gè)高原鼠兔樣本采自青藏高原不同地區(qū)(表1)，將鼠兔腿部肌肉組織置于2 mL離心管中，并用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇保存。

表1 高原鼠兔采樣位點(diǎn)信息

取約15 mg肌肉組織，用試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取基因組DNA，通過瓊脂糖檢測和NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，USA)對抽提DNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測。

1.2 簡化基因組測序

取3個(gè)檢驗(yàn)合格的基因組DNA樣本送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行簡化基因組測序，所用的測序技術(shù)為Super GBS，試驗(yàn)流程為：限制性酶切→連接接頭→PCR擴(kuò)增→混合建庫→測序。

1.3 SSR位點(diǎn)信息分析與引物設(shè)計(jì)

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控，然后用Stacks軟件包(v 1.34)進(jìn)行聚類，根據(jù)聚類結(jié)果進(jìn)行組裝過濾，得到最終的重疊群。利用MISA軟件進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，搜索標(biāo)準(zhǔn)為單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基，重復(fù)次數(shù)分別在10、6、5、5、5、5次以上，相鄰的SSR序列不少于100 bp。為了提高SSR的精度，取SSR與InDel的交集，條件為：①選取變異堿基數(shù)≥5的InDel；②InDel出現(xiàn)的位置位于SSR區(qū)域上下游5 bp內(nèi)。然后利用軟件Primer v3.2.5.0設(shè)計(jì)SSR引物。

1.4 引物驗(yàn)證

從設(shè)計(jì)的引物中隨機(jī)挑選70對引物進(jìn)行合成，合成時(shí)為了減少熒光引物合成成本，在正向引物的5′端添加1個(gè)M13接頭序列。然后對8個(gè)高原鼠兔基因組DNA樣品進(jìn)行RCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20.0 μL，包含2.0 μL 10×Taqbuffer(含Mg2+)(Takara，大連寶生物)，5 U/μLTaqDNA聚合酶(Takara)0.2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，0.2 μL總DNA，用滅菌超純水補(bǔ)至20.0 μL。

反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95℃預(yù)變性8 min；95℃變性45 s，52—55℃退火45s，72℃延伸80s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。反應(yīng)在伯樂熱循環(huán)PCR儀S1000(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上進(jìn)行。

對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型，利用GeneScan v3.1.2讀取數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAD-seq測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測

高原鼠兔DNA的RAD-seq測序共獲得原始數(shù)據(jù)2.14 Gb，對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過濾后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)1.99 Gb(表2)。平均Q30(測序堿基質(zhì)量值，即測序時(shí)錯(cuò)誤識別的概率為0.1%、正確率為99.9% 的堿基比例)為89.11%，平均GC比例為50.47%，結(jié)果表明樣本的數(shù)據(jù)量足夠，測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠性較高，GC比例正常。

表2 高原鼠兔DNA的RAD-seq基因組測序結(jié)果

2.2 簡化基因組中SSR位點(diǎn)信息

由表3可知，通過MISA軟件分析共檢測到7 064個(gè)SSR位點(diǎn)，其中完全重復(fù)型(perfect)有6 806個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的96.35%，而復(fù)合型較少，僅有258個(gè)，占總位點(diǎn)的3.65%。SSR位點(diǎn)中，單核苷酸重復(fù)基序最多，數(shù)量為3 260個(gè)，占總位點(diǎn)的46.15%；其次為二核苷酸重復(fù)基序，數(shù)量為2 710個(gè)，占總位點(diǎn)的38.37%；三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重復(fù)基序數(shù)量分別為535、256、40個(gè)，分別占總位點(diǎn)的7.57%、3.62%和0.57%；六核苷酸數(shù)量最少，僅有5個(gè)，占總位點(diǎn)的0.07%。在完全重復(fù)型SSR位點(diǎn)中，六核苷酸類型重復(fù)基序平均長度最長，可達(dá)到31 bp；單核苷酸類型重復(fù)基序的平均長度最短，為12 bp。在這些SSR位點(diǎn)中，單核苷酸重復(fù)SSR位點(diǎn)中A/T為優(yōu)勢基序，占該類型基序的98.22%；二核苷酸重復(fù)基序類型有11種，其中優(yōu)勢基序?yàn)锳G/TC，數(shù)量分別為392、433個(gè)；三核苷酸重復(fù)基序有50種，AAC/TTG為主要基序；四核苷酸重復(fù)基序的種類數(shù)在完全重復(fù)型中最多，達(dá)83種，其中AAAC/TTTG為主要基序；五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)基序類型數(shù)量分別為30和3，主要基序分別為AAAAC/CAAAA和CCTCAC/GCAGGA。

表3 高原鼠兔簡化基因組中SSR位點(diǎn)信息

高原鼠兔基因組不同類型SSR位點(diǎn)基序的重復(fù)次數(shù)如表4所示。單核苷酸的基序重復(fù)次數(shù)主要集中在10—14次；二核苷酸基序的SSR主要集中在6—9次重復(fù)；三核苷酸基序的SSR主要為5—6次重復(fù)；四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸基序的SSR均為4次重復(fù)。

表4 高原鼠兔不同類型及不同重復(fù)次數(shù)的SSR位點(diǎn)基序的分布數(shù)量

2.3 多態(tài)性SSR引物的篩選

在獲得的7 064個(gè)高原鼠兔SSR位點(diǎn)中，通過取SSR與InDel的交集，獲得182處符合條件的SSR區(qū)域，并最終設(shè)計(jì)出90對引物。隨機(jī)選取70對引物，對8個(gè)高原鼠兔樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中無條帶或主條帶不明顯的有7對，有條帶但無多態(tài)性的引物有3對，有18對引物在8個(gè)DNA樣本的檢測中僅有2種多態(tài)性，其余42對引物具有單一條帶，且多態(tài)性較好，占總檢測引物的60%，引物具體信息如表5所示。

表5 42對具有單一條帶的高原鼠兔多態(tài)性SSR引物信息

續(xù)表5

3 討論

目前SSR標(biāo)記的篩選方法主要有比較基因組法、微衛(wèi)星富集文庫法和基于組學(xué)的篩選法等，其中比較基因組法需要先獲取近緣種微衛(wèi)星位點(diǎn)信息，且不能篩選出該物種特有的微衛(wèi)星，而富集文庫篩選法前期需要進(jìn)行SSR序列的富集及文庫構(gòu)建等復(fù)雜、繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作流程[17-18]。本研究使用簡化基因組測序技術(shù)對高原鼠兔的SSR位點(diǎn)進(jìn)行篩選，既簡化了操作流程，同時(shí)位點(diǎn)的篩選效率也高于磁珠富集文庫對高原鼠兔的篩選結(jié)果[10]。同為二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序也被用于SSR標(biāo)記的篩選中，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得的SSR位點(diǎn)均位于基因的編碼區(qū)，而SSR標(biāo)記大多位于非編碼區(qū)，且該區(qū)域的SSR標(biāo)記通常具有更高的遺傳變異，簡化基因組序列可以均勻分布在物種的基因組中，通過該技術(shù)可以獲得更多具有高變異SSR標(biāo)記[19]。另外，無論與微衛(wèi)星富集文庫篩選法，還是轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)相比，RAD-seq所需費(fèi)用都更低，因此該方法是針對目標(biāo)物種進(jìn)行特異性SSR標(biāo)記篩選的經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法。

在高原鼠兔的SSR位點(diǎn)中，數(shù)量最多的核苷酸重復(fù)基序是單核苷酸，其次是二核苷酸，這與Tóth等[20]在嚙齒類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的二堿基重復(fù)基序數(shù)量最多并不一致。同時(shí)，高原鼠兔重復(fù)基序的類型也表現(xiàn)出一定的偏倚性，如二核苷酸重復(fù)基序中優(yōu)勢基序?yàn)锳G/TC；三核苷酸中AAC/TTG為主要基序，這也與其他物種存在差異[16，21]，而重復(fù)序列的數(shù)量與類型所表現(xiàn)出的差異可能都與物種特異性有關(guān)。Zane等[19]認(rèn)為通常不將單堿基重復(fù)序列作為微衛(wèi)星位點(diǎn)，應(yīng)排除這一類型基序，但在本研究的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，有7對引物擴(kuò)增的單堿基重復(fù)序列表現(xiàn)出明顯的單一條帶以及較好的多態(tài)性。

為節(jié)省熒光引物的設(shè)計(jì)成本，在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中于正向引物上添加了M13接頭，但該接頭有可能會(huì)對引物的結(jié)構(gòu)和結(jié)合特異性產(chǎn)生一定影響，導(dǎo)致擴(kuò)增的失敗[21]。同時(shí)由于驗(yàn)證樣本僅有8個(gè)，使得剩余的18對引物的多態(tài)性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，但總體來說用RAD-seq來篩選SSR標(biāo)記時(shí)，在隨機(jī)選取的70對引物中，成功獲得了具有特異性單一條帶，且多態(tài)性較好的引物有42對，占總數(shù)量的60%，表明具有較高的篩選效率。獲得的42對引物足夠滿足高原鼠兔遺傳多樣性，種群遺傳結(jié)構(gòu)，譜系地理等問題的研究需求。