薩如拉 文靜 于田田 魯爽 田恬 王思宇 劉敏

摘 要：為了有效提取燕麥麩皮中的蛋白質(zhì)，以燕麥麩皮為原料，測定蛋白含量、脫脂，以超聲時間、加水量、加酶量為單因素，使用超聲輔助酶法進行提取試驗，使用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，計算蛋白質(zhì)提取率，確定各單因素的最佳提取條件。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗，得燕麥麩皮蛋白的最佳提取工藝：超聲時間60min，加水量60mL，加酶量0.06mg，燕麥麩皮蛋白質(zhì)提取率為最高的31.40%。

關(guān)鍵詞：燕麥麩皮;蛋白質(zhì);提取率;正交試驗;單因素試驗

中圖分類號：TQ461? 文獻標(biāo)識碼：A? 文章編號：1673-260X（2021）01-0017-04

燕麥?zhǔn)且环N低糖、高蛋白質(zhì)食品，優(yōu)質(zhì)蛋白的含量為11.3%～19.9%，在糧食作物中居首位[1]。燕麥蛋白是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，主要由谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白組成[2]，而燕麥蛋白主要集中在燕麥麩皮中，更重要的是燕麥蛋白中必需氨基酸組成與每日攝取量的標(biāo)準(zhǔn)基本相同，是所有谷物中氨基酸最平衡的食品，可有效地促進人體生長發(fā)育，其中賴氨酸和精氨酸含量較高[3]。同時，燕麥蛋白的功效比、化學(xué)評分、生物價也是植物蛋白中的佼佼者[2]。燕麥麩皮是燕麥加工過程中的副產(chǎn)物，除了一些麩皮作為動物飼料以外大部分未被有效利用，會被焚燒或填埋處理，浪費蛋白質(zhì)資源的同時污染環(huán)境。因此，為了提高燕麥麩皮的附加價值及優(yōu)質(zhì)蛋白資源的有效利用率，如何從燕麥麩皮中更高效、更合理地提取燕麥蛋白成為研究的首要問題。

目前，國內(nèi)外研究的燕麥麩皮提取蛋白的方法主要有堿提酸沉法、酶法、超聲波法及復(fù)合法[4-6]。堿提酸沉法利用蛋白質(zhì)在堿性條件易溶，而在酸性條件達到其等電點而生成沉淀的性質(zhì)，用堿提酸沉達到分離或提純的目的，是目前植物蛋白生產(chǎn)中常用的方法，但其缺點是使用了大量的酸和堿[7]。酶法具有設(shè)備簡單，反應(yīng)條件溫和，水解速度快、提取時間短、提取率高、不產(chǎn)生污染等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但是卻大大增加了工業(yè)成本并且控制條件也較嚴(yán)格[8]。為了提高提取率，在堿提酸沉和酶解基礎(chǔ)上再加超聲波處理，也有以上這些方法以不同形式復(fù)合的復(fù)合提取方法。

超聲波輔助酶法可以減少酶加量、縮短酶提取時間，并可以提高蛋白質(zhì)提取率及純度。本研究以提高燕麥麩皮的蛋白質(zhì)提取率、縮短提取時間、降低提取成本、改善蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值為目的，選用了超聲輔助酶解法來提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)，為提取優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料、試劑及儀器設(shè)備

燕麥麩皮、牛血清白蛋白、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、正己烷、氫氧化鈉、乙醇、磷酸、考馬斯亮藍G-250、超聲波清洗器、恒溫水浴鍋、分光光度計、離心機。

2 實驗方法

2.1 燕麥麩皮中蛋白質(zhì)含量的測定

燕麥麩皮中蛋白質(zhì)含量的測定按照GB 5009.5—2010進行測定[9]。

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取10mg牛血清蛋白，溶于100mL蒸餾水中，配成100μg/mL溶液。再稱取100g考馬斯亮藍G-250溶于50mL 90%的乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100mL，蒸餾水定容至1000mL。取6支試管，按表1配制牛血清白蛋白液各1mL。從各試管中吸取0.1mL溶液，分別放入10mL具塞試管中，加入5mL考馬斯亮藍G-250試劑，混勻，放置2min，在595nm下比色測吸光值。

2.3 燕麥麩皮的脫脂

稱取一定量的燕麥麩皮加入錐形瓶中，以料液比1：6（g/mL）加入正己烷，室溫下震蕩脫脂3h，過濾，并用冷卻的正己烷沖洗3次，將脫脂的燕麥麩晾干，備用。

2.4 酶的篩選

取3g脫脂燕麥麩皮加入60mL水，所加酶的最適溫度下超聲60min，使用1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，加入0.06g酶，酶解60min，90℃滅酶10min，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，測定蛋白質(zhì)含量。每種酶進行3次重復(fù)試驗并且取其平均值。

2.5 單因素實驗

測定不同超聲時間，不同加液量和不同加酶量下燕麥麩皮蛋白質(zhì)的提取率，每種因素進行3次重復(fù)試驗并且取其平均值。

2.5.1 超聲時間對燕麥麩皮蛋白提取率的影響

取3g脫脂燕麥麩皮加入60mL蒸餾水，在45℃下分別超聲30、40、50、60、70min，使用1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.5，加入0.06g堿性蛋白酶，酶解60min，90℃滅酶10min，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，測定蛋白質(zhì)含量，計算提取率。

2.5.2 加水量對燕麥麩皮蛋白提取率的影響

取3g脫脂燕麥麩皮，分別加入40、50、60、70、80mL蒸餾水，在45℃下超聲60min，使用1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.5，加入0.06g堿性蛋白酶，酶解60min，90℃滅酶10min，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，測定蛋白質(zhì)含量，計算提取率。

2.5.3 加酶量對燕麥麩皮蛋白提取率的影響

取3g脫脂燕麥麩皮加入60mL蒸餾水，在45℃下，超聲60min，使用1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.5，分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10g堿性蛋白酶，酶解60min，90℃滅酶10min，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，測定蛋白質(zhì)含量，計算提取率。

2.5.4 提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)的正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，在每個單因素中選取三個具有最高提取率的梯度進行正交試驗，并使用 L9（33）正交設(shè)計（見表3）。

2.5.5 驗證試驗

單因素試驗的最佳組合與正交試驗最優(yōu)組合進行比較選取提取率高的一組作為最終的提取條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 燕麥麩皮中蛋白質(zhì)含量測定

燕麥麩皮中蛋白質(zhì)含量為15.2%。

3.2 蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以A595nm吸光值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為

y=0.9971x+0.0025，R2=0.9901。

燕麥麩皮蛋白提取率（%）

=×100

3.3 酶的篩選

以燕麥麩皮蛋白提取率為指標(biāo)，分別計算了中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及其混合酶在最佳條件下燕麥麩皮蛋白的提取率，試驗結(jié)果如表4所示，燕麥蛋白的最佳用酶為堿性蛋白酶，在單因素試驗及正交試驗中采用堿性蛋白酶為燕麥麩皮蛋白的降解酶。

3.4 單因素實驗

3.4.1 不同超聲時間對燕麥麩皮蛋白提取率的影響

如圖2所示，超聲提取時間在60min之前，燕麥麩皮蛋白質(zhì)的提取率隨著超聲時間的增加而增加，到60min的時候達到最大提取率，再延長超聲時間時提取率變化不大，且略有下降的趨勢。超聲時間較短的時候燕麥麩皮中的蛋白質(zhì)還沒完全提取，超聲時間過長時被提取的蛋白質(zhì)可能被破壞而降低提取率。因此，本試驗中60min的超聲時間為最適合的提取時間。

3.4.2 不同加酶量對燕麥麩皮蛋白提取率的影響

如圖3所示，加酶量較少的時候燕麥麩皮蛋白質(zhì)的提取率較低，因為酶未能滿足底物需要的酶量，加酶量增加至0.06mg的時候提取率最大，說明0.06mg酶正好能滿足底物所需酶量，但酶量繼續(xù)增加的時候提取率開始下降，可能因為酶量過度而進一步把提取的蛋白質(zhì)降解成氨基酸或短肽而使提取率下降。

3.4.3 不同加水量對燕麥麩皮蛋白提取率的影響

如圖4所示，燕麥麩皮蛋白質(zhì)的提取率隨著加水量的增加而增加，當(dāng)加水量達到50mL時，提取率最高可達30.14%，當(dāng)加水量超過50mL后，提取率有下降的趨勢。這是由于加水量較小時，體系黏度較大，不利于傳質(zhì)。但加水量過大時，酶與底物的接觸概率下降，使蛋白質(zhì)的提取率降低。

3.4.4 正交試驗

在燕麥麩皮蛋白質(zhì)提取單因素試驗的基礎(chǔ)上，對超聲時間、加水量、加酶量等三個因素進行正交試驗。進一步優(yōu)化超聲輔助酶解法提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)的工藝條件，結(jié)果見表5，從表5中的極差R可知，影響蛋白質(zhì)提取率的因素的主次順序是：超聲時間>加酶量>加水量，優(yōu)化后的提取工藝條件為A2B3C1，即超聲時間為60min，加水量為60mL，加酶量為0.06mg，提取率為31.40%。

3.4.5 驗證實驗

從燕麥麩皮中提取蛋白質(zhì)的單因素試驗確定的最佳條件下進行蛋白質(zhì)的提取，即超聲時間60min，加水量為50mL，加酶量為0.06mg，提取率為30.14%。蛋白質(zhì)提取正交試驗中提取率最高的組合為A2B3C1，即超聲時間為60min，加水量60mL，加酶量為0.06mg，提取率能為31.40%。因此最佳提取條件為超聲時間60min，加水量60mL，加酶量0.06mg。

4 結(jié)論

本研究使用超聲輔助酶解法提取燕麥麩皮蛋白質(zhì)，通過單因素試驗及正交試驗確定了提取蛋白質(zhì)的最佳工藝，即超聲時間60min，加水量60mL，加酶量0.06mg，蛋白質(zhì)提取率為31.40%。超聲波輔助酶法可以減少酶加量、縮短酶提取時間，降低提取成本、改善蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。本研究為提取優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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參考文獻：

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〔8〕劉健壘，李英杰，郝李平.均勻試驗設(shè)計優(yōu)化酶法提取燕麥全粉蛋白質(zhì)研究[J].中國糧油學(xué)報，2013，28（08）：78-82.

〔9〕GB 5009.5-2010 食品中蛋白質(zhì)的測定.