王 欣,劉天奇,徐 瑩,張 會(huì),李 杰

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

脯氨酰內(nèi)肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)[EC 3.4.21.26]是一種脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶,能特異性水解多肽中脯氨酸殘基或少數(shù)疏水性氨基酸殘基的肽鍵[1]。廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)[2]、食品[3]和釀造[4]等領(lǐng)域。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,脯氨酰內(nèi)肽酶可加速腸道中谷蛋白的降解,是治療乳糜瀉的潛在藥物[5-6];在食品領(lǐng)域,脯氨酰內(nèi)肽酶可對(duì)酪蛋白水解物進(jìn)行脫苦處理,從而提高食物的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;在釀造領(lǐng)域,在啤酒生產(chǎn)的過程中添加脯氨酰內(nèi)肽酶可以提高麥芽汁中氨基酸的含量,提升口感,防治冷渾濁[7]。但是天然微生物中脯氨酰內(nèi)肽酶表達(dá)量低,導(dǎo)致其生產(chǎn)成本高,無法大規(guī)模應(yīng)用。目前市場(chǎng)上只有帝斯曼公司生產(chǎn)的食品級(jí)脯氨酰內(nèi)肽酶產(chǎn)品,市場(chǎng)價(jià)格高達(dá)900元/公斤。因而研究脯氨酰內(nèi)肽酶的重組表達(dá)具有重要意義。

表1 引物名稱及其序列Table 1 Primer names and sequences

黑曲霉具有卓越的分泌蛋白能力,在工業(yè)發(fā)酵條件下分泌蛋白產(chǎn)量可達(dá)到40 g/L,并能進(jìn)行糖基化等翻譯后修飾。同時(shí),又廣泛應(yīng)用于食品和發(fā)酵工業(yè),具有高度的安全性和堅(jiān)實(shí)的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)基礎(chǔ)[8]。因此,黑曲霉是表達(dá)真核生物蛋白,尤其是食品級(jí)蛋白的理想系統(tǒng)。同時(shí),天然的黑曲霉就能分泌脯氨酰內(nèi)肽酶,所以黑曲霉是分泌表達(dá)食品級(jí)脯氨酰內(nèi)肽酶的理想系統(tǒng)[9]。徐曉紅等[10]在黑曲霉中表達(dá)了脯氨酰內(nèi)肽酶,在5 L發(fā)酵罐試驗(yàn)中,酶活達(dá)到6.89 U/mL(酶活定義:pH5.0 37 ℃條件下每分鐘從 Z-Gly-Pro-pNA釋放1 μmol/L pNA所用的酶量為一個(gè)酶活力單位)。雖然黑曲霉是表達(dá)脯氨酰內(nèi)肽酶的理想系統(tǒng),但是,通過黑曲霉表達(dá)的蛋白酶常常由于背景蛋白的存在導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)量低下且不純的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),葡糖淀粉酶信號(hào)肽glaA和α-淀粉酶信號(hào)肽amyA對(duì)黑曲霉分泌表達(dá)蛋白有促進(jìn)作用。本研究嘗試通過使用強(qiáng)啟動(dòng)子和高效分泌信號(hào)肽提高脯氨酰內(nèi)肽酶在黑曲霉中的表達(dá)量,通過消除背景蛋白提高分泌表達(dá)的脯氨酰內(nèi)肽酶的純度,為高產(chǎn)高純度的食品級(jí)脯氨酰內(nèi)肽酶探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌感受態(tài)DH5α康為世紀(jì)有限公司;黑曲霉TH-2 肇東市日成酶制劑有限公司惠贈(zèng);pMD-19T 寶生物工程有限公司;根癌農(nóng)桿菌AGL1、AGL1(pSZHΔpyrG)、pSZHG2R、pSZHG2R-SglaA、pSZHG2R-SamyA 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌遺傳實(shí)驗(yàn)室保存。

熱循環(huán)儀T960 杭州晶格科學(xué)儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱HPS-160、組合振蕩培養(yǎng)箱HZQ-Z2 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司;超凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;瓊脂糖凝膠電泳儀、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀 BIO-RAD公司;高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;紫外可見分光光度計(jì)UV-5800PC 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物序列 根據(jù)Genebank中黑曲霉protA基因序列(gene ID:4982766),用DNAMAN 8.0軟件設(shè)計(jì)protA基因擴(kuò)增引物P1、P2、P3。根據(jù)表達(dá)載體pSZHG2R、pSZHG2R-SglaA、pSZHG2R-SamyA中5′GLA、3′GLA同源臂序列設(shè)計(jì)同源重組菌株鑒定引物P4、P5。P6～P9為敲除酸穩(wěn)定的α-淀粉酶過程所用引物(表1)。

1.2.2 過表達(dá)重組菌株構(gòu)建

1.2.2.1 黑曲霉重組菌株TH2-protAS的構(gòu)建 以黑曲霉TH2基因組DNA為模板,引物P1、P2用于擴(kuò)增帶有自身信號(hào)肽編碼區(qū)的protAS基因,測(cè)序正確后,用限制性內(nèi)切酶ApaI、HindIII雙酶切protAS基因片段和表達(dá)載體pSZHG2R,連接后構(gòu)建表達(dá)載體pSZHG2R-protAS;T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。通過凍融法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1中[11]。吸取農(nóng)桿菌單菌落作為PCR的模板,使用引物P2、P4進(jìn)行菌落PCR鑒定。鑒定正確的農(nóng)桿菌菌株命名為AGL1(pSZHG2R-protAS)。

將黑曲霉TH2菌絲體勻漿打碎,取100 μL與等體積活化后的農(nóng)桿菌混合,涂布在含200 μmol/L乙酰丁香酮的PDA固體培養(yǎng)基覆蓋的玻璃紙上。28 ℃培養(yǎng)2 d后,將玻璃紙倒置覆蓋在含200 mmol/L頭孢、200 mmol/L潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)1 d后取下玻璃紙,繼續(xù)培養(yǎng)直至長(zhǎng)出黑曲霉菌落。將黑曲霉菌落接種到含200 mmol/L頭孢、200 mmol/L潮霉素的PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次篩選,培養(yǎng)5～7 d至長(zhǎng)出大量菌絲。提取重組黑曲霉菌株基因組DNA[12],用引物P4、P5進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以pSZHG2R-protAS為陽性對(duì)照,TH2基因組DNA為陰性對(duì)照,使用ApaI、HindIII雙酶切PCR產(chǎn)物。將目標(biāo)片段進(jìn)行DNA電泳,篩選出與陽性對(duì)照一致且沒有陰性對(duì)照條帶的轉(zhuǎn)化子,命名為TH2-protAS。

圖1 protA基因表達(dá)載體的T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of T-DNA region structure of protA gene expression vector注:GLA5和GLA3是用于同源重組的glaA基因的同源臂,hph是篩選標(biāo)記。

1.2.2.2 重組菌株TH2-protAS分泌蛋白檢測(cè) 將重組菌株按1∶10的比例接種到100 mL工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃250 r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)10 d,取發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.2.3 分泌蛋白的去糖基化 采用酶解法去除N-糖基化。使用N-糖苷酶F水解GlcNAc-Asn鍵,通過酶切N-糖鏈中相鄰的兩個(gè)GlcNAc間的糖苷鍵,釋放出含有一個(gè)GlcNAc的肽段,且去除復(fù)合型糖鏈等結(jié)構(gòu)。操作方法首先將發(fā)酵液上清用Millipore Amicon Ultra超濾離心管(截留分子量為10 ku)濃縮20倍。將2.5 μL濃縮液與3 μL N-糖苷酶F在25 μL緩沖體系中37℃孵育16 h,之后經(jīng)SDS-PAGE分析樣品。

1.2.2.4 重組菌株脯氨酰內(nèi)肽酶酶活測(cè)定 脯氨酰內(nèi)肽酶酶活定義:pH5.0 37 ℃條件下每分鐘從Z-Gly-Pro-pNA 釋放1 μmol/L pNA所用的酶量為一個(gè)酶活力單位。底物配制:準(zhǔn)確稱取0.1706 g的Z-Gly-Pro-pNA溶解于100 mL添加40%二惡烷的pH5.0 0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液中。酶活力測(cè)定步驟:試管中加入緩沖液0.25 mL和0.2 mol/L Na2CO33 mL,混合均勻。作為空白對(duì)照對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零。向樣品和樣品對(duì)照試管中同時(shí)加入0.25 mL底物和1.0 mL緩沖液,于37 ℃水浴預(yù)熱3 min,向樣品中加入0.1 mL酶液,混合均勻后37 ℃水解10 min,樣品對(duì)照直接置于37 ℃水浴10 min,水解完成后向所有試管中加入0.2 mol/L Na2CO33 mL,混合均勻,最后向樣品空白對(duì)照試管中加入0.1 mL酶液,搖晃試管使其混合均勻。于A410 nm下測(cè)量樣品和樣品空白對(duì)照的吸光度數(shù)值并做記錄,計(jì)算酶活力。樣品和樣品空白對(duì)照均設(shè)置三組平行樣。酶活力計(jì)算公式參考江婷論文[13]。

1.2.3 不同信號(hào)肽脯氨酰內(nèi)肽酶重組菌株構(gòu)建 以黑曲霉TH2基因組DNA為模板,引物P2、P3用于擴(kuò)增不帶自身信號(hào)肽編碼區(qū)的protA基因。測(cè)序正確后,用限制性內(nèi)切酶NheI、HindIII雙酶切protA基因片段和表達(dá)載體pSZHG2R-SglaA、pSZHG2R-SamyA,連接后構(gòu)建表達(dá)載體pSZHG2R-SglaA-protA、pSZHG2R-SamyA-protA。T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)如圖1所示。表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與重組菌株的篩選鑒定方法參照上述1.2.2,篩選的純合菌株分別命名為TH2-SglaA-protA、TH2-SamyA-protA。

1.2.4 重組菌株分泌背景蛋白的消除 首先用農(nóng)桿菌AGL1(pSZHΔpyrG)轉(zhuǎn)化黑曲霉TH2-SglaA-protA,敲除黑曲霉自身編碼乳清酸核苷-5′-單磷酸脫羧酶的pyrG基因。篩選培養(yǎng)基為CD,PCR檢測(cè)引物為P6、P7。以pSZHΔpyrG為陽性對(duì)照,TH2-SglaA-protA基因組DNA為陰性對(duì)照。篩選出與陽性對(duì)照一致條帶,而沒有陰性對(duì)照條帶的轉(zhuǎn)化子,即為敲除pyrG基因的純合重組菌株TH2-SglaA-protA(ΔpyrG)。然后用農(nóng)桿菌AGL1(pSZHA-pyrG)轉(zhuǎn)化黑曲霉TH2-SglaA-protA(ΔpyrG),敲除編碼酸穩(wěn)定的α-淀粉酶的asaA基因。篩選培養(yǎng)基為CDM,PCR檢測(cè)引物為P8、P9。以pSZHA-pyrG為陽性對(duì)照,TH2-SglaA-protA(ΔpyrG)基因組DNA為陰性對(duì)照。篩選出與陽性對(duì)照一致條帶,而沒有陰性對(duì)照條帶的轉(zhuǎn)化子,即為敲除asaA基因的純合重組菌株TH2-SglaA-protA(ΔasaA::pyrG)。表達(dá)載體的T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 質(zhì)粒pSZHΔpyrG、pSZHA-pyrG的 T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of T-DNA region structure of plasmids pSZHΔpyrG and pSZHA-pyrG

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)脯氨酰內(nèi)肽酶重組菌株的分泌表達(dá)

2.1.1 帶有自身信號(hào)肽目的基因的擴(kuò)增 擴(kuò)增了編碼protAS基因片段2113 bp,見圖3。 序列分析結(jié)果表明,序列與黑曲霉CBS513.88基因組序列相似性為100%,含有10個(gè)內(nèi)含子序列,protAS基因編碼526個(gè)氨基酸的含信號(hào)肽的脯氨酰內(nèi)肽酶。

圖3 基因protASPCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of protASgene注：M:DL 4500 Marker。

2.1.2 重組菌株TH2-protAS的篩選 黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果見圖4。圖4中6號(hào)菌株轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)了與陽性對(duì)照一致且沒有陰性對(duì)照條帶,證明獲得了目的基因整合在glaA位點(diǎn)的純合轉(zhuǎn)化子,命名為TH2-protAS。

圖4 黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組PCR酶切鑒定Fig.4 Genomic PCR enzyme digestion identification of Aspergillus niger transformants M:DL 4500 Marker;0:空白對(duì)照;1:陰性對(duì)照;2:陽性對(duì)照; 3-8:黑曲霉轉(zhuǎn)化子PCR雙酶切結(jié)果(ApaI、HindIII)。

圖5 重組菌株TH2-protAS分泌蛋白SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE detection results of recombinant strain TH2-protAS secreted protein注:M:116.0 kD Protein Marker;TH2:出發(fā)菌株 10 d發(fā)酵樣品;TH2-protAS:重組菌株10 d發(fā)酵樣品。

2.1.3 重組菌株分泌蛋白的檢測(cè) 取出發(fā)菌株TH2、重組菌株TH2-protAS的發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),發(fā)現(xiàn)65～116.0 kDa的區(qū)別于葡糖淀粉酶的彌散條帶(圖5),與預(yù)測(cè)的分子量56.45 kDa不符。分析是由于脯氨酰內(nèi)肽酶不同程度糖基化所致,因此對(duì)其進(jìn)行了去糖基化分析,去除蛋白中所有N-糖基化。在去除N-糖基化后,得到了一條約56 kDa大小的目的蛋白條帶(圖6)。對(duì)蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析,共檢測(cè)到21條脯氨酰內(nèi)肽酶肽段(表2),覆蓋44.68%的氨基酸序列,證明為黑曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶條帶。

圖6 重組菌株TH2-protAS分泌蛋白 去糖基化后的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE detection results of the recombinant strain TH2-SglaA-protA secreted protein after deglycosylation 注:M:116.0 ku Protein Marker; 0:重組菌株TH2-protAS發(fā)酵樣品; 1:去糖基化后樣品;2:黑曲霉TH2發(fā)酵樣品。

表2 目的蛋白條帶質(zhì)譜分析結(jié)果Table 2 Target protein band mass spectrometry analysis results

2.2 不同信號(hào)肽對(duì)脯氨酰內(nèi)肽酶表達(dá)的影響

2.2.1 不帶自身信號(hào)肽目的基因的擴(kuò)增 擴(kuò)增了編碼protA基因片段2043 bp,見圖7。 序列分析結(jié)果表明,序列與黑曲霉CBS513.88基因組序列相似性為100%,含有10個(gè)內(nèi)含子序列,protA基因編碼504個(gè)氨基酸的不含信號(hào)肽的脯氨酰內(nèi)肽酶。

圖7 基因protA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR amplification results of protA gene注:M:DL 4500 Marker。

圖8 不同黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組PCR酶切鑒定Fig.8 Genomic PCR enzyme digestion identification of different Aspergillus niger transformants注:(a)重組菌株TH2-SglaA-protA(b)TH2-SamyA-protA;M:DL 4500 Marker; 0:空白對(duì)照;1:陰性對(duì)照;2:陽性對(duì)照;3～8:黑曲霉轉(zhuǎn)化子PCR雙酶切結(jié)果(NheI、HindIII)。

2.2.2 重組菌株TH2-SglaA-protA、TH2-SamyA-protA的篩選 黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果見圖8。圖8a中3～8號(hào)菌株、圖8b中3～4號(hào)菌株轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)了與陽性對(duì)照一致且沒有陰性對(duì)照條帶,證明獲得了目的基因整合在glaA位點(diǎn)的純合轉(zhuǎn)化子,分別命名為TH2-SglaA-protA、TH2-SamyA-protA。

2.2.3 重組菌株TH2-SglaA-protA、TH2-SamyA-protA的分泌表達(dá) 取出發(fā)菌株黑曲霉TH2和重組菌株TH2-protAS、TH2-SglaA-protA、TH2-SamyA-protA的發(fā)酵液上清,測(cè)定脯氨酰內(nèi)肽酶酶活。重組菌株TH2-protAS的最高酶活(發(fā)酵10 d)為1.70 U/mL，明顯高于出發(fā)菌株TH2的0.41 U/mL。重組菌株TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA的最高酶活力分別為2.19、1.91 U/mL。比重組菌株TH2-protAS分別提高29.1%、12.6%(圖9)。證明glaA信號(hào)肽和amyA信號(hào)肽能促進(jìn)脯氨酰內(nèi)肽酶的分泌表達(dá),且glaA信號(hào)肽的效果要優(yōu)于amyA信號(hào)肽。為了提高脯氨酰內(nèi)肽酶的純度,接下來對(duì)重組菌株TH2-SglaA-protA進(jìn)行基因操作,從而敲除背景蛋白。

圖9 重組菌株發(fā)酵液上清脯氨酰內(nèi)肽酶酶活檢測(cè)結(jié)果Fig.9 Results of proteoyl endopeptidase activity of recombinant strain fermentation broth supernatant注:不同小寫字母表示在0.05水平上 菌株之間具有顯著差異(n=3)。

2.3 重組菌株TH2-SglaA-protA中分泌背景蛋白的消除

本實(shí)驗(yàn)用pyrG雙向篩選標(biāo)記敲除了酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因asaA,獲得重組菌株TH2-SglaA-protA(ΔasaA::pyrG)。將重組菌株TH2-SglaA-protA(ΔasaA::pyrG)在添加1 g/100 mL硫酸銨的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,取發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明,酸穩(wěn)定的α-淀粉酶蛋白條帶已經(jīng)被成功敲除,并且隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,α-淀粉酶蛋白條帶逐漸消失。從而顯著提升了脯氨酰內(nèi)肽酶的純度(圖10)。

圖10 重組菌株TH2-SglaA-protA(ΔasaA::pyrG) 發(fā)酵液上清SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.10 SDS-PAGE detection results of supernatant of recombinant strain TH2-SglaA-protA(ΔasaA::pyrG)注:M:170.0 ku Protein Marker;0:出發(fā)菌株8 d發(fā)酵樣品; 1～8:重組菌株4～11 d發(fā)酵樣品。

3 討論與結(jié)論

研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因置換技術(shù)在黑曲霉TH2中成功表達(dá)內(nèi)源脯氨酰內(nèi)肽酶,搖瓶發(fā)酵酶活達(dá)到1.70 U/mL,這一結(jié)果證明黑曲霉可作為高效表達(dá)分泌蛋白、尤其是內(nèi)源分泌蛋白的理想宿主。

分泌信號(hào)肽能使蛋白質(zhì)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng),是分泌蛋白表達(dá)量的主要影響因素之一。本研究選用黑曲霉TH2中高效分泌表達(dá)的內(nèi)源蛋白葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的信號(hào)肽替換脯氨酰內(nèi)肽酶自身的信號(hào)肽,使分泌的脯氨酰內(nèi)肽酶分別提升了29.1%和12.6%。證明glaA信號(hào)肽具有更好的引導(dǎo)蛋白分泌表達(dá)的效果,這與Xu的研究結(jié)果一致[14]。

黑曲霉TH2的主要分泌背景蛋白有葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α-淀粉酶和α-淀粉酶。前期研究中發(fā)現(xiàn)向TH2發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1 g/100 mL的硫酸銨,可使發(fā)酵后期培養(yǎng)基pH下降,導(dǎo)致α-淀粉酶被降解(未發(fā)表)。本研究用脯氨酰內(nèi)肽酶基因protA取代了葡糖淀粉酶基因glaA,敲除了酸穩(wěn)定α-淀粉酶基因asaA,從而消除了分泌背景蛋白中的葡糖淀粉酶和酸穩(wěn)定的α-淀粉酶。結(jié)合向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1 g/100 mL的硫酸銨,消除了3種主要的分泌背景蛋白,顯著提升了分泌表達(dá)的脯氨酰內(nèi)肽酶的純度。使用該菌株在滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司20 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中,發(fā)酵液中脯氨酰內(nèi)肽酶的酶活為11.86 U/mL,達(dá)到了高產(chǎn)高純度脯氨酰內(nèi)肽酶的目的。

提高曲霉中重組蛋白分泌量的方法有很多,還包括:啟動(dòng)子改造[15-16]、密碼子優(yōu)化[17-18]、基因多拷貝[19-21]、共表達(dá)非折疊蛋白響應(yīng)(UPR)相關(guān)基因[22-24]、敲除蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因[25]等。本研究前期嘗試通過對(duì)protA基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,共表達(dá)UPR相關(guān)基因bipA、pdiA、cnx、hacAi來提高脯氨酰內(nèi)肽酶的表達(dá)量。但結(jié)果顯示,脯氨酰內(nèi)肽酶的表達(dá)量都沒有得到提升,并且共表達(dá)bipA、pdiA、cnx還降低了脯氨酰內(nèi)肽酶的表達(dá)量。分析可能是因?yàn)檫@些基因的共表達(dá)激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑(ERAD),導(dǎo)致更多的目的蛋白被降解。因此,如果要進(jìn)一步提高黑曲霉中脯氨酰內(nèi)肽酶的表達(dá)量,還需要對(duì)其轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊和降解過程進(jìn)行更為深入的研究。