黃 玉,尼瑪扎西,薛正蓮,張國強(qiáng),*

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000; 2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,西藏拉薩 850000)

金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一種廣譜的昆蟲病原真菌,具有不污染環(huán)境,無殘留,對人畜無害等優(yōu)點(diǎn)[1],被認(rèn)為是一種環(huán)境友好型殺蟲劑。金龜子綠僵菌通過其分生孢子粘附在昆蟲體表,然后利用氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)萌發(fā),同時(shí)分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶[2-3]等穿透昆蟲表皮,在昆蟲體內(nèi)大量繁殖,產(chǎn)生毒素[4],最后導(dǎo)致昆蟲死亡[5]。金龜子綠僵菌現(xiàn)已成功應(yīng)用到田間,正緩慢而穩(wěn)定地取代傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥,取得了較好的防治效果[6-7]。但田間的不利環(huán)境會限制綠僵菌的感染性和有效性[8-9]。在田間試驗(yàn)中,紫外線和高溫降低了孢子的存活率,毒力大大降低,阻礙了綠僵菌分生孢子的作用[10-11]。

當(dāng)綠僵菌在生長過程中暴露于紫外、溫度等亞致死脅迫下時(shí),綠僵菌分生孢子對紫外線和熱的耐受性會提高[12-13]。陳瑞勤等[14]利用紫外線和亞硝酸復(fù)合誘變,選育出孢子海藻糖含量顯著提高的抗逆誘變株M105-32。高溫會抑制真菌在野外的持久性和藥效,是商業(yè)發(fā)展的限制因素[15],生產(chǎn)對脅迫溫度更耐受的分生孢子可提高真菌在田間的有效性。因此,篩選具有抗逆性的優(yōu)良綠僵菌菌株具有重要的意義。

近年來,為了獲得綠僵菌優(yōu)良菌株,大部分是通過紫外誘變來獲取[16-19]。紫外誘變使DNA形成嘧啶二聚體,阻礙堿基間的正常配對,從而引起微生物的突變或死亡[20-21]。它是研究中常用的誘變手段,且所用到的設(shè)備簡單,操作方便,誘變的效率高。目前尚未見利用ARTP誘變技術(shù)增強(qiáng)綠僵菌性能的報(bào)道。常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP),一種新興的誘變方式,已經(jīng)成功應(yīng)用于細(xì)菌、真菌等微生物,具有突變率高等優(yōu)點(diǎn)[22-24]。ARTP誘變技術(shù)操作簡便,易得到穩(wěn)定的突變菌株,利用兩種誘變方式會使得突變位點(diǎn)增多,突變效果增強(qiáng)。ARTP和紫外誘變相結(jié)合,突變率大大提高。戴劍漉等[25]通過ARTP和紫外復(fù)合誘變獲得發(fā)酵單位比出發(fā)菌株提高221%、埃莎霉素Ⅰ組分含量提高192%的正突變株IA-425。

本研究以金龜子綠僵菌421為材料,采用ARTP和紫外線復(fù)合誘變處理菌株,以小菜蛾為生測對象,篩選出產(chǎn)孢量高、耐紫外、毒力強(qiáng)的優(yōu)良誘變株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)421 本實(shí)驗(yàn)室保藏;PDA培養(yǎng)基(g/L) 土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1000 mL;Tween 80 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;小菜蛾 河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。

HSP-70BE恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海力辰邦西儀器科技有限公司;ARTP-Ⅱ型誘變育種儀 北京思清源生物科技有限公司;85-2恒溫磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸液的制備 取5 mL 0.05%的Tween 80溶液打在新鮮的培養(yǎng)基平板上,將孢子沖洗下來放入到含有玻璃珠的10 mL離心管中,并振蕩均勻,用四層的滅菌擦鏡紙過濾,稀釋后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù),將孢子懸液的濃度調(diào)整至107個(gè)孢子/mL左右[26]。

1.2.2 ARTP誘變方法 將載片灼燒30 s,放入滅菌平板中,待冷卻后,取10 μL 107個(gè)孢子/mL孢子懸液均勻涂于載片。紫外燈滅菌30 min后,開始誘變操作,誘變時(shí)間設(shè)定為0、10、20、30、40、50、60 s,放電功率為100 W,氣流量為10 SLM。待誘變處理完畢后,將裝有載片的EP管振蕩洗脫,稀釋相應(yīng)的倍數(shù),取100 μL涂布于平板中,28 ℃培養(yǎng)3 d,計(jì)算致死率。

式中:A:處理組平板長出的菌落數(shù);B:對照組平板長出的菌落數(shù)。

1.2.3 紫外誘變方法 將磁力攪拌器放入超凈工作臺中,用酒精清洗超凈工作臺和磁力攪拌器,固定距離30 cm,紫外滅菌20 min。吸取5 mL 107個(gè)孢子/mL孢子懸液加入于已滅菌的帶有轉(zhuǎn)子的平板中,打開磁力攪拌器和培養(yǎng)皿蓋,在黑暗條件下用30 W紫外燈照射0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 s。照射結(jié)束后,關(guān)閉紫外燈。將取出的不同照射時(shí)間的菌液稀釋合適的倍數(shù),取100 μL涂布于培養(yǎng)基平板中,以上操作均在紅外光下操作。28 ℃避光培養(yǎng)3 d,計(jì)算致死率。

1.2.4 ARTP結(jié)合紫外復(fù)合誘變 孢子懸液經(jīng)ARTP處理40 s后直接進(jìn)行紫外誘變,稀釋并涂布于平板,重復(fù)3次,28 ℃避光培養(yǎng),計(jì)算致死率。

1.2.5 初篩方法 將復(fù)合處理后的誘變株培養(yǎng)3 d后,觀察不同時(shí)間的平板的生長情況,計(jì)數(shù)平板上的菌落,對誘變株進(jìn)行初篩,將平板上長出來的菌落和原始菌株一起點(diǎn)種于新的PDA培養(yǎng)基上,于第6 d時(shí)測量并記錄菌落生長直徑。比較初始菌株和誘變株,篩選誘變后能產(chǎn)孢、菌落生長速度快、生長直徑大的誘變株。

1.2.6 復(fù)篩方法

1.2.6.1 抗紫外線能力篩選 將初篩得到的菌株在紫外燈下照射5 min,選擇萌發(fā)率高的、抗紫外能力較強(qiáng)的菌株。

1.2.6.2 毒力篩選 把原始菌株和通過1.2.6.1得到的誘變株一起進(jìn)行小菜蛾的毒力試驗(yàn),選擇對小菜蛾毒力強(qiáng)的菌株。用浸泡法將供試107個(gè)孢子/mL的綠僵菌孢子懸液接種于小菜蛾 2 齡幼蟲,篩選具高侵染能力的綠僵菌菌株。幼蟲死亡后,將蟲尸進(jìn)行保濕培養(yǎng),5 d后,檢查這些蟲體是否長出菌絲及分生孢子,以確認(rèn)它們是否死于綠僵菌感染[27]。每組處理20頭,重復(fù)3組,采用0.05% Tween80溶液作為對照,每天觀察小菜蛾的癥狀并記錄,統(tǒng)計(jì)小菜蛾的死亡數(shù),并計(jì)算出校正致死率,同時(shí)通過每天的致死率做相關(guān)性分析,求出LT50和毒力回歸方程,用SPSS軟件做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

校正致死率(%)=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)×100

1.2.7 突變菌株耐熱性試驗(yàn) 取107個(gè)孢子/mL濃度的孢子懸液1 mL于10 mL EP管中,將其置于水浴鍋中,分別在35、40、45、50、55、60 ℃溫度下處理0.5 h,處理完畢后,將其稀釋涂布于PDA平板中,重復(fù)3次,培養(yǎng)3 d后,測定萌發(fā)率。

式中:A:處理組平板長出的菌落數(shù);B:對照組平板長出的菌落數(shù)。

1.2.8 突變菌株穩(wěn)定性試驗(yàn) 將獲得的誘變優(yōu)良菌株在PDA平板上連續(xù)傳代點(diǎn)種,用4 mm的打孔器挖取菌塊,測定菌株連續(xù)6 代的產(chǎn)孢量,檢測其遺傳穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均處理三次,采用IBM SPSS Statistics 25進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,通過Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩選育

2.1.1 ARTP誘變選育 以金龜子綠僵菌421孢子懸液為出發(fā)菌株,探索ARTP最佳誘變時(shí)間。從圖1看,金龜子綠僵菌對ARTP很敏感,在60 s時(shí)致死率已接近100%。當(dāng)照射時(shí)間為40 s時(shí),致死率為80.06%。為獲得生長快、產(chǎn)量高的優(yōu)良菌株,一般把80%～90%的致死率選定為誘變時(shí)間[28],因此本研究誘變處理時(shí)間選定40 s。

圖1 ARTP誘變致死曲線Fig.1 ARTP mutagenic lethal curve

2.1.2 紫外誘變 將孢子懸液在30 W紫外燈下照射處理不同時(shí)間后,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長致死率逐漸升高,結(jié)果見圖2,照射300 s時(shí),致死率達(dá)到100%,因此,將紫外誘變的時(shí)間范圍確定在0～300 s內(nèi)。

圖2 紫外誘變致死曲線Fig.2 Ultraviolet mutagenic lethal curve

2.1.3 雙誘變條件復(fù)合誘變 由圖3知,將經(jīng)ARTP處理40 s后的孢懸液再進(jìn)行紫外照射處理,發(fā)現(xiàn)在紫外處理120、150、180 s時(shí),致死率分別為70.38%、94.81%、97.97%,考慮到本研究是結(jié)合ARTP和紫外復(fù)合誘變,為保證后續(xù)有足夠的菌株,因此將120 s作為誘變時(shí)間。

圖3 ARTP后紫外誘變致死曲線 Fig.3 Lethal curve of ultraviolet mutagenesis after ARTP

2.1.4 誘變株生長情況 在經(jīng)過ARTP和紫外復(fù)合誘變后,將誘變后長出的菌落和出發(fā)菌株點(diǎn)種到新的PDA平板上,通過比較出發(fā)菌株和誘變菌株的生長直徑(d)大小及產(chǎn)孢快慢,共篩得了28株生長直徑比原始菌株大的誘變菌株,編號AU3～AU101,結(jié)果見表1。

28株誘變菌株中有5株誘變株AU6、AU23、AU34、AU43和AU48產(chǎn)孢較快,其中AU34產(chǎn)孢特征見圖4A,這5株誘變株在48 h后開始產(chǎn)孢,而原始菌株則是在60 h后開始產(chǎn)孢。其余誘變菌株產(chǎn)孢表現(xiàn)與初始菌株一致,但菌落大小較初始菌株大,其中AU34結(jié)果如圖4B。

圖4 原始菌株M原與誘變株AU34的 產(chǎn)孢快慢和生長直徑大小比較Fig.4 Comparison of sporulation speed and growth diameter between the original strain and the mutant strain注:A:3 d后產(chǎn)孢快慢;B:6 d后生長直徑大小。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

2.2.1 抗紫外線能力復(fù)篩 將初篩得到的28株誘變菌株在紫外燈下照射5 min后,發(fā)現(xiàn)28株誘變菌株中AU3、AU34兩株菌株比原始菌株更抗紫外線照射(見表2),菌株AU3、AU34在照射5 min后的存活率分別為2.36%、3.18%,較原始菌株高,其中菌株AU34的存活率更高,耐紫外線能力更強(qiáng)。因此,選用菌株AU3,AU34進(jìn)行下一步的毒力篩選。

表1 原始菌株與誘變株生長直徑大小比較Table 1 Comparison of the growth diameter of the original strain and the mutant strain

表2 不同菌株在紫外5 min下的存活率Table 2 Survival rate of different strains under UV 5 min

表3 金龜子綠僵菌對小菜蛾的毒力Table 3 Toxicity of Metarhizium anisopliae to Plutella xylostella

2.2.2 毒力篩選 將原始菌株、AU3、AU34的孢子懸液作用于小菜蛾,每天定時(shí)觀察小菜蛾的死亡數(shù),做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見表3?？梢钥闯鲈季辍⒕闍U3、菌株AU34處理的供試小菜蛾校正致死率分別是80.36%、82.14%、85.71%,其中菌株AU34對小菜蛾的校正致死率較高,從半數(shù)致死時(shí)間看,菌株AU34所用的LT50最短,為6.12 d。因此,菌株AU34對小菜蛾的毒力最好。

2.3 菌株耐熱性測定

耐熱性是衡量昆蟲病原真菌在野外環(huán)境中持久性的指標(biāo)之一[29]。陶星虎[30]通過高溫?zé)峒砗Y選出耐高溫的蝗綠僵菌突變體,得到三株M2-1、M2-2和M2-7較耐熱的菌株,其中M2-7耐熱性最好,并對其進(jìn)行了抗紫外能力等性能測定,與野生型WT的差異不顯著。本研究在對原始菌株和誘變株AU34進(jìn)行耐熱性試驗(yàn)后,發(fā)現(xiàn)萌發(fā)率隨溫度升高而逐漸下降,高溫限制了綠僵菌菌絲的生長,在55 ℃時(shí)原始菌株和誘變株的菌落形態(tài)較小且生長速率慢,兩株菌株在60 ℃時(shí)均無法生長。由圖5可以看出突變株AU34比原始菌株更耐熱,耐熱能力有較大提高。

2.4 菌株遺傳穩(wěn)定性測定

通過測量生長6 d的產(chǎn)孢量,原始菌株的產(chǎn)孢量為0.995±0.316(108cell/cm2),菌株AU34的產(chǎn)孢量為1.63±0.22(108cell/cm2),比原始菌株提高了63.81%。對菌株AU34進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn),結(jié)果見表4,通過連續(xù)6代產(chǎn)孢量檢測,菌株AU34具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究通過ARTP和紫外復(fù)合誘變,成功篩選到一株生長飽滿、產(chǎn)孢快、抗紫外線能力強(qiáng)、耐高溫、毒力強(qiáng)的優(yōu)良菌株AU34,產(chǎn)孢量為1.63±0.22(108cell/cm2),比原始菌株提高了63.81%,在檢測傳代6次的產(chǎn)孢量后,該誘變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。其中在測定耐熱性時(shí)發(fā)現(xiàn)突變菌株AU34較原始菌株的耐高溫能力極大提高,表明ARTP-紫外復(fù)合誘變對提高綠僵菌的性能是有效的。而且利用雙誘變條件獲得的綠僵菌菌株產(chǎn)孢時(shí)間提前、孢子產(chǎn)量提高、毒力增強(qiáng),提高了其作為微生物殺蟲劑的應(yīng)用潛力,表明經(jīng)ARTP-紫外復(fù)合誘變可以成功選育出綠僵菌優(yōu)良菌株,有利于提高現(xiàn)有殺蟲劑的使用效果,為篩選優(yōu)良綠僵菌菌株提供了新的途徑。

表4 菌株AU34的遺傳穩(wěn)定性Table 4 Genetic stability of strain AU34

圖5 原始菌株與AU34的耐熱性比較Fig.5 Comparison of heat tolerance between original strain and AU34