張明，楊經文，陳懷生，李悅，施學智，梁泳欣，童華生*

1廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院/廣東省清遠市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科一區(qū)，廣東清遠 511500；2深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東深圳 518020；3解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學科/解放軍熱區(qū)損傷與組織修復重點實驗室，廣州 510010

中暑是一種可伴隨多臟器損傷的致死性疾病，有研究顯示其28 d和2年病死率可高達58%和71%[1]。肝損傷可繼發(fā)于重癥中暑，除替代及移植以外的治療手段十分有限，常導致患者病情惡化甚至死亡[2]。迄今為止，熱打擊誘導肝損傷的致病機制仍不完全明確，除了熱的直接作用外，炎癥損傷可能是病情進展的主要原因[3]。進一步探索熱打擊誘導肝細胞炎癥損傷的致病機制及干預手段是改善中暑患者預后的重要手段。本課題組前期研究發(fā)現，高遷移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1，HMGB1)水平與中暑患者臟器損傷和死亡相關[4]。另外，HMGB1可通過激活炎癥小體依賴的信號通路，上調熱打擊后肝細胞內白細胞介素(interleukin，IL)的表達，擴大炎癥反應并造成肝損傷[5]。據此推斷，HMGB1可能是控制該致病過程的潛在靶點。

氯沙坦是一種功能強大的血管緊張素受體拮抗劑，越來越多的證據顯示，除了控制血壓的作用外，氯沙坦還具有抑制炎癥損傷的效用[6]。中暑大鼠的體內實驗發(fā)現，血管緊張素系統(tǒng)紊亂可以促進炎癥損傷[7]。還有研究證實，氯沙坦可以在炎癥損傷的靶器官內下調HMGB1表達，改善預后[8]。然而，氯沙坦是否能通過HMGB1對熱打擊誘導的肝細胞炎癥損傷起作用尚未見報道。本研究通過構建中暑大鼠肝損傷和熱打擊肝細胞系損傷兩種模型，觀察評估氯沙坦通過HMGB1對肝細胞炎癥損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 氯沙坦(losartan，LOS)購自美國Selleck公司，丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)購自美國Sigma-Aldrich公司，重組HMGB1蛋白購自美國R&D Systems公司。谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-18、HMGB1檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司?；钚匝醮?reactive oxidatespecies，ROS)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、CCK-8試劑盒、細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術公司?？笻MGB1、抗活化的半胱天冬酶-1(caspase-1)一抗購自英國Abcam公司。檢測方法參照使用說明書嚴格執(zhí)行。

1.2 中暑大鼠模型的構建 健康雄性SPF級SD大鼠，體重220～250 g，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供(實驗動物許可證編號：4400002100012396)。動物實驗流程通過南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批(倫理審批編號：20170822001)。將大鼠隨機分為對照組、中暑組、中暑氯沙坦組。對照組被置于未升溫的人工氣象艙中2 h，腹腔注射2 ml注射用水。中暑組和中暑氯沙坦組根據文獻[5]提供的方案造模：將適應環(huán)境的大鼠置于(39.5±0.2) ℃溫度及60%±5%濕度的人工氣象艙中，允許大鼠自由活動，但不提供飲水和食物。當大鼠尾動脈血壓上升至頂點并下降、核心體溫超過42 ℃時，認定為造模成功。中暑組和中暑氯沙坦組大鼠分別在造模后接受復溫、飼水，腹腔注射2 ml注射用水或50 mg/kg氯沙坦[8]。幾乎全部中暑大鼠均能存活至熱打擊結束，但只有40%大鼠存活至造模后9 h。故在造模階段兩個中暑組大鼠各造模25只，留取存活超過9 h的大鼠血液和肝組織樣本，隨機抽取存活大鼠實驗編號并接納其樣本入組，最終保證樣本量每組9只。

1.3 熱打擊肝細胞模型構建 大鼠肝細胞系HBL3A購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。將培養(yǎng)傳代后的細胞系隨機分為對照組、熱打擊組和熱打擊氯沙坦組。對照組在正常環(huán)境下培養(yǎng)，不接受熱打擊。熱打擊組和熱打擊氯沙坦組按文獻[5]提供的方案造模：將正常培養(yǎng)的HBL3A細胞系置于43 ℃、含5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中接受打擊1 h后，在上清中分別加入空白培養(yǎng)基或氯沙坦(濃度至10 μmol/L)[8]，并重新置入37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱靜置9 h。每組細胞中取9個培養(yǎng)皿，收集上清及細胞。采用ELISA法測定細胞上清IL-1β、IL-18及HMGB1水平；熱打擊結束1 h后，分別添加梯度濃度的重組HMGB1(0.5、1.0、1.5 μg/ml)和H2O2(0.2 mmol/L)至氯沙坦干預的肝細胞上清中，并測定上清IL-1β、IL-18及HMGB1水平。

1.4 病理形態(tài)學觀察 肝組織經甲醛固定、HE染色，病理科醫(yī)師在不了解分組的情況下在光鏡下觀察肝組織切片并評分。評分方法按文獻[5]提出的標準，根據肝組織各個視野中的紅細胞滯留、胞質褪色、空泡化、核濃縮、核碎裂及核衰落等6個指標判定，取平均值后計算總和。

1.5 Western blotting檢測HMGB1及caspase-1 p10表達水平 將每皿HBL3A細胞刮離皿壁，混勻后分裝出完全等量的2份樣本。其中一份在低溫條件下按照碧云天公司出品的細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒的操作流程，提取胞質蛋白；另一份采用裂解液提取總蛋白。采用常規(guī)方法行總蛋白濃度測定和Western blotting檢測，根據總蛋白β-actin表達量校正蛋白濃度，并最終測定細胞質HMGB1，caspase-1 p10及總HMGB1表達水平。采用ImageJ軟件檢測條帶光密度(OD)值，計算各目的蛋白與內參β-actin的比值。

1.6 流式細胞儀測定細胞內ROS水平 按ROS檢測試劑盒說明書裝載熒光探針至肝細胞內，懸浮細胞并收集培養(yǎng)基，調配至相近的細胞密度并設定流式細胞儀熒光參數為488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長，分別測定陽性信號。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料先通過Kolmogorov-Smirnov檢測正態(tài)性，符合正態(tài)分布的采用表示。多組數據間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 氯沙坦緩解熱打擊誘導的肝細胞損傷 體內實驗中，大鼠血清ALT、肝組織MPO、肝臟病理形態(tài)分析顯示：與對照組比較，中暑組和中暑氯沙坦組的ALT、MPO和病理組織學評分明顯增高(P＜0.05)。與中暑組相比較，中暑氯沙坦組上述指標明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1)。體外實驗中，與對照組比較，熱打擊組和熱打擊氯沙坦組上清LDH水平增高，細胞存活率顯著下降(P＜0.05)。同樣，與熱打擊組比較，熱打擊氯沙坦組上清LDH水平下降，細胞存活率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

圖1 氯沙坦對中暑大鼠肝臟損傷的緩解作用Fig.1 The protective effect of losartan on the damaged liver tissue of heatstroke rats

2.2 氯沙坦抑制熱打擊肝細胞HMGB1的轉移和釋放 在體內實驗中，ELISA結果證實：與對照組比較，中暑大鼠血清HMGB1水平明顯增高，而氯沙坦對其有抑制作用(P＜0.05，圖3A)。體外實驗中，與對照組比較，熱打擊組肝細胞上清HMGB1水平明顯增高，氯沙坦干預后，上清HMGB1水平與熱打擊組比較明顯下降(P＜0.05，圖3B)；同時，Western blotting檢測結果顯示，肝細胞質HMGB1占總HMGB1的比例在熱打擊后明顯增加，而氯沙坦可以抑制該比例的增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3D)。

圖2 氯沙坦對熱打擊HBL3A細胞損傷的緩解作用Fig.2 Theprotective effect of losartan on the damaged HBL3A cell line exposed to heat stress

圖3 氯沙坦抑制熱打擊肝細胞中HMGB1的轉移和釋放Fig.3 The inhibitory effect of losartan on the transfer and secretion of HMGB1 in rat's hepatocytes after heat stress

2.3 氯沙坦通過HMGB1抑制caspase-1、IL-1β、IL-18水平 體內實驗中，中暑組大鼠肝組織IL-1β、IL-18的表達水平明顯上調，加入氯沙坦后，抑制了上述促炎因子的水平(圖4A，P＜0.05)。體外實驗中，肝細胞在接受熱打擊后，caspase-1表達隨HMGB1的上調而上調，同時上清IL-1β、IL-18的表達明顯增加，而氯沙坦干預對caspase-1和促炎因子的表達具有抑制作用(P＜0.05，圖3E，圖4B)。HMGB1藥物抑制劑EP(5 mmol/L)明顯降低了熱打擊肝細胞上清IL-1β、IL-18的水平，增高了肝細胞存活率(圖4C、D)，補充重組HMGB1則抵消了氯沙坦對IL-1β、IL-18的抑制作用(圖4E，P＜0.05)。

圖4 熱打擊肝細胞中氯沙坦通過HMGB1抑制IL-1β、IL-18表達Fig.4 Losartan inhibit the expression of IL-1β and IL-18 through HMGB1 in rat's hepatocytes after heat stress

2.4 氯沙坦通過抑制熱打擊肝細胞ROS水平調控HMGB1釋放 熱打擊使肝細胞內ROS水平增高，而氯沙坦能夠抑制ROS的增加(圖5A，P＜0.05)。補充0.2 mmol/L過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)能夠顯著增高氯沙坦干預的熱打擊肝細胞上清中HMGB1水平，差異有統(tǒng)計學意義(圖5B，P＜0.05)。

3 討 論

圖5 氯沙坦對熱打擊HBL3A細胞內活性氧簇水平的影響Fig.5 Effect of losartan on the reactive oxygen species (ROS)in HBL3A cells stimulated by heat stress

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，主要存在于真核細胞核內并參與轉錄的調控等過程[9]。當細胞受到刺激或死亡時，HMGB1能主動或被動地由細胞核內易位到胞質或釋放到細胞外行使“促炎”功能[10-11]，充當“損傷相關分子模式”誘導炎癥對靶器官的損傷，該現象已經在很多感染或非感染疾病中被觀察到[12-15]。還有研究證實，作為一種炎癥損傷性疾病，中暑能誘導HMGB1向患者和動物血清中大量釋放，并與患病個體預后相關[4,16]。并且，在原本即有大量HMGB1表達的肝臟中，熱打擊能夠促進HMGB1的轉移釋放并成為肝細胞炎癥損傷的重要介質[5]。本課題組的前期研究還發(fā)現HMGB1的特異性抗體能夠緩解肝損傷，也從反面證明了HMGB1在熱打擊肝損傷炎癥反應中的促炎作用[17]。和前人的研究相似，本研究也驗證了原本主要存在于細胞核內的HMGB1，在熱打擊后轉移釋放到細胞質和細胞培養(yǎng)上清中，而且這種改變也伴隨了周圍細胞的炎癥損傷。

研究發(fā)現，熱打擊后被大量釋放的HMGB1會被晚期糖基化終產物受體和Toll樣受體識別，通過NLRP3炎癥小體依賴的炎癥通路活化caspase-1，后者剪切活化IL-1β和IL-18引起擴散的炎癥反應，成為熱打擊誘導肝臟損傷的重要機制[5,14]。相似結果也在其他以肝細胞構建的模型中出現[18]。本研究沒有重復驗證HMGB1被模式受體識別及誘導NLRP3炎癥小體聚集的過程，但同樣觀察到熱打擊誘導釋放的HMGB1及外源添加的HMGB1都能增加下游效應因子IL-1β和IL-18的水平，并引起炎癥損傷；相反的，HMGB1抑制劑有利于控制IL-1β和IL-18水平。這意味著HMGB1在熱打擊肝細胞的炎癥反應中起到促炎作用。當然，本研究亦不能排除HMGB1通過其他通路及效應因子共同誘導熱打擊肝細胞炎癥損傷的可能性。

為了抑制HMGB1而減輕炎癥損傷，除上述的HMGB1抗體外，Hagiwara等[16]也嘗試采用非特異性的重組血栓調節(jié)蛋白下調HMGB1并發(fā)揮保護性作用?？蛇z憾的是，無論是HMGB1抗體還是血栓調節(jié)蛋白，都不是臨床上容易獲得的藥物。為了尋找潛在有效的藥物來治療中暑肝損傷這種致命性疾病，本研究進行了進一步的干預實驗。

氯沙坦是一種血管緊張素受體拮抗劑，是治療高血壓病的一線藥物。越來越多的研究發(fā)現，氯沙坦及其同族藥物還存在緩解炎癥損傷的作用，能夠抑制包括HMGB1在內的多種炎性因子的釋放[19-20]。Hagiwara等[8]發(fā)現，氯沙坦能夠抑制膿毒癥HMGB1的上調，減輕靶器官損傷；Nair等[21]發(fā)現，氯沙坦能抑制腎小管上皮細胞中HMGB1的上調和炎癥損傷；Kikuchi等[22]證實了該類藥物在卒中疾病中抑制HMGB1的作用。另外，肝臟組織也存在血管緊張素受體，且能夠由其引發(fā)炎癥損傷，說明肝臟組織存在該類藥物發(fā)揮抗炎作用的基礎[23]；同時，在熱相關疾病中也存在著血管緊張素系統(tǒng)激活引起炎癥損傷的證據[7,24]。但是，氯沙坦通過調控HMGB1干預熱相關炎癥損傷的假設未被實驗評估過。本研究結果顯示，氯沙坦對熱打擊肝細胞的保護作用伴隨了HMGB1釋放的抑制，補充HMGB1逆轉了氯沙坦的保護作用，均提示氯沙坦在熱打擊肝損傷中通過抑制HMGB1發(fā)揮作用的可能性。

氯沙坦抑制HMGB1的分子通路仍不明確。Hagiwara等[8]認為，氯沙坦抑制了HMGB1上游的IκB磷酸化；而Nair等[21]則認為與NF-κB的激活受抑制有關。血管緊張素受體均是與異三聚體G蛋白相聯(lián)系繼而激活以ROS為主的第二信使，從而發(fā)揮效能，故血管緊張素受體拮抗劑的抗炎作用很可能與其對ROS的抑制有關[25]。有研究證實，血管緊張素系統(tǒng)在肝臟中發(fā)揮促炎作用也是以ROS作為媒介信使的[23]。同時，無論受到何種機制的調控，ROS都是調節(jié)HMGB1易位、釋放和活化的共同機制[26]。本研究發(fā)現，氯沙坦可抑制熱打擊肝細胞內ROS水平并抑制HMGB1釋放，而補充過氧化氫能夠逆轉氯沙坦對HMGB1釋放的抑制作用，由此足以推測ROS是氯沙坦調控HMGB1機制中的關鍵點。

綜上所述，作為臨床上易獲得的藥物，氯沙坦能通過調控熱打擊肝細胞中HMGB1的釋放抑制炎癥反應，發(fā)揮保護作用，提示了其具有作為治療中暑肝損傷潛在藥物而被進一步研究開發(fā)的價值。