蔣德旗，徐蘭程，毛書慧，趙仕花

(1. 玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，2. 廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 玉林 537000)

中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失為帕金森病(Parkinson’s disease，PD)主要病理特征。PD多巴胺能神經(jīng)元死亡與膠質(zhì)細(xì)胞活化、氧化應(yīng)激、炎癥損傷等因素關(guān)系密切。褪黑激素可通過(guò)抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、清除自由基、抑制炎癥因子表達(dá)及抗神經(jīng)毒性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑激素能夠抑制6-羥基多巴所致PD大鼠模型黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化，并使黑質(zhì)紋狀體部位酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量增多，發(fā)揮PD保護(hù)作用[3]。褪黑激素可改善PD動(dòng)物模型的行為學(xué)功能，減少多巴胺能神經(jīng)元死亡，延緩PD發(fā)展[4]，但相關(guān)分子機(jī)制還不明確。Sirtuin 3(SIRT3)屬于線粒體蛋白，具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、能量代謝、保護(hù)線粒體功能等作用，在PD等神經(jīng)疾病中發(fā)揮一定保護(hù)作用[5-6]。多項(xiàng)研究表明[7-8]，褪黑激素可上調(diào)SIRT3發(fā)揮抗氧化、抑制炎癥損傷。但SIRT3是否介導(dǎo)褪黑激素對(duì)PD多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用，還不清楚。本研究探討了褪黑激素保護(hù)PD多巴胺能神經(jīng)元的作用機(jī)制是否與SIRT3功能相關(guān)，以進(jìn)一步了解褪黑激素的神經(jīng)保護(hù)作用分子機(jī)制，為PD治療藥物研制提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠，8～10周齡，♂，體質(zhì)量約20 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(桂)2014-0002。適用性飼養(yǎng)3 d后，開展相關(guān)試驗(yàn)。

1.2 試劑1-甲基,4-苯基,1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)(M0896)、褪黑激素(M5250)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SIRT3(ab86671)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)(ab13533)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)(ab15323)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；TH(sc73152)、離子鈣結(jié)合蛋白1(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1) (sc32725)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)(AF0006)抗體和相關(guān)二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；氧化應(yīng)激與炎癥因子測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 儀器ABI ViiA 7熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Hema9600基因擴(kuò)增儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)；蛋白電泳與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng) (美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型構(gòu)建與動(dòng)物分組48只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組，每組16只。模型組和治療組小鼠每天給予30 mg·kg-1MPTP腹腔注射1次，連續(xù)注射7 d，建立亞急性PD模型，對(duì)照組小鼠同時(shí)給予等量生理鹽水；治療組小鼠在MPTP腹腔注射的同時(shí)再給予褪黑激素(10 mg·kg-1)腹腔注射，連續(xù)給藥14 d，對(duì)照組和模型組同時(shí)給予等量生理鹽水。給藥結(jié)束正常飼養(yǎng)3 d后，處死分離腦組織，組織切片或裂解，以待進(jìn)一步分析檢測(cè)。

2.2 免疫組化檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)TH、Iba-1表達(dá)隨機(jī)選取各組小鼠，快速斷頭取腦，分離中腦黑質(zhì)組織，石蠟切片，厚度為20 μm，每連續(xù)5張切片取1張，分別行TH 和Iba-1染色。切片用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗3次，每次5 min；再用3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，0.1 mol·L-1PBS沖洗3次，每次5 min；5% 牛血清蛋白封閉液室溫封閉30 min；加入適量兔抗小鼠TH、Iba-1一抗(1 ∶100)，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜；0.1 mol·L-1PBS沖洗3次，每次5 min；加入山羊抗兔二抗，室溫孵育20 min，0.1 mol·L-1PBS沖洗3次，每次5 min；加入生物素標(biāo)記室溫孵育40 min；經(jīng)PBS沖洗后二氨基聯(lián)苯胺顯色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、光鏡下觀察并攝片。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖形分析軟件分析黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)吸光度值，并在顯微鏡下對(duì)黑質(zhì)區(qū)Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.3 氧化應(yīng)激及炎癥因子水平檢測(cè)隨機(jī)選取各組小鼠，快速斷頭處死，分離中腦組織，組織剪碎，加適量組織裂解液，低溫勻漿機(jī)中研磨完全裂解，4 ℃，10 000 r·min-1離心15 min，取上清，保存于-20 ℃冰箱中待測(cè)。用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法嚴(yán)格按說(shuō)明書操作步驟檢測(cè)腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)和白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)含量，采用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，分別采用DCFH-DA熒光探針、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定中腦組織活性氧(reactive oxygen species，ROS)、SOD水平。

2.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分析SIRT3 mRNA水平按照試劑盒步驟提取RNA，去基因組，檢測(cè)純度無(wú)蛋白質(zhì)污染，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，輕柔混勻后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下：42 ℃ 60 min，72 ℃ 15 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。SIRT3基因引物序列：上游引物5′-ATGCCTGAAGACAGCTCCAACAC-3′，下游引物5′-AGACATCCCTGGTCAGCCTTTCC-3′；GAPDH基因引物序列：上游引物5′-GGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC-3′，下游引物5′-GAGACAACCTGGTCCTCAGTGTA-3′。按照Premix TaqⅡ試劑盒反應(yīng)體系加入試劑和引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min：95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。通過(guò)細(xì)胞閾值循環(huán)數(shù)值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品初始cDNA進(jìn)行相對(duì)量計(jì)算。

2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平隨機(jī)選取各組小鼠，快速斷頭取腦，分離中腦黑質(zhì)組織，組織剪切，加入蛋白裂解液，低溫勻漿機(jī)中研磨，充分裂解后，4 ℃，10 000 r·min-1離心15 min，取上清。采用BCA法測(cè)定各樣品總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，沸水浴5 min使蛋白變性，蛋白上樣量為每孔20 μg，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入封閉液稀釋的SIRT3、Iba-1、SOD2、iNOS抗體和內(nèi)參GAPDH抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜緩沖液(Tris buffered saline tween，TBST)洗膜，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗膜，膜放于電化學(xué)發(fā)光液中反應(yīng)2 min，保鮮膜封閉，暗室中用X膠片感光、顯影、定影、掃描保存圖片。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析目標(biāo)蛋白表達(dá)條帶的灰度值，以GAPDH蛋白表達(dá)量作為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1 褪黑激素干預(yù)對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目的影響免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，褪黑激素干預(yù)后，治療組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目則明顯多于模型組，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 1。

3.2 褪黑激素干預(yù)對(duì)黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用與對(duì)照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)，褪黑激素干預(yù)后，治療組小鼠黑質(zhì)區(qū)Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目則明顯少于模型組，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 2。Western blot檢測(cè)結(jié)果也表明，模型組小鼠黑質(zhì)組織Iba-1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，與模型組比較，治療組Iba-1表達(dá)水平則顯著降低(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 2 Effect of melatonin on number of Iba-1-positive cells in substantia nigra of PD mice n=4)

3.3 褪黑激素干預(yù)對(duì)中腦組織氧化應(yīng)激及炎癥因子水平的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，模型組小鼠中腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS和MDA、炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，SOD活性低于對(duì)照組(P<0.05)。褪黑激素干預(yù)后，治療組小鼠中腦組織氧化應(yīng)激及炎癥均獲得一定程度改善，ROS、MDA、TNF-α和IL-1β水平降低，SOD活性增強(qiáng)，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Tab 1。

Fig 3 Effect of melatonin on Iba-1 protein expression in substantia nigra of PD mice n=4)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel.

Tab 1 Effects of melatonin on oxidative stress and inflammatory factors in midbrain tissue of PD mice n=16)

3.4 褪黑激素干預(yù)對(duì)黑質(zhì)SIRT3 mRNA水平的影響實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組黑質(zhì)組織SIRT3 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，褪黑激素干預(yù)后，治療組黑質(zhì)組織SIRT3 mRNA水平相比模型組表現(xiàn)出一定程度提升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Effect of melatonin on level of SIRT3 mRNA expression in substantia nigra of PD mice n=4)

3.5 褪黑激素干預(yù)對(duì)黑質(zhì)SIRT3及相關(guān)蛋白表達(dá)的作用免疫熒光結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組黑質(zhì)組織SIRT3染色熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.05)，與模型組比較，治療組熒光則顯著增強(qiáng)(P<0.05)，見Fig 5。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組黑質(zhì)組織SIRT3、SOD2蛋白表達(dá)量明顯減小(P<0.05)，iNOS表達(dá)量顯著增多(P<0.05)，褪黑激素干預(yù)后，治療組黑質(zhì)組織3種蛋白表達(dá)則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，與模型組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 5 Effects of melatonin on expression of SIRT3 in substantia nigra of PD mice by immunofluorescence n=4)

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑激素能夠減少M(fèi)PTP所致PD小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失，并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，與Naskar等[9]研究結(jié)果一致。此外，Bassani等[10]發(fā)現(xiàn)，在魚藤酮大鼠PD模型上，褪黑激素保護(hù)TH陽(yáng)性神經(jīng)元及維持多巴胺水平，褪黑激素在6-羥基多巴大鼠PD模型形成4 d后仍可改善運(yùn)動(dòng)癥狀，同時(shí)還可減少TH陽(yáng)性神經(jīng)元的壞死并能保護(hù)紋狀體內(nèi)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，褪黑激素可降低PD模型小鼠中腦組織ROS、MDA、TNF-α、IL-1β水平，增強(qiáng)SOD活性，從而抑制氧化應(yīng)激及炎癥損傷。毛崇丹等[11]研究顯示，褪黑激素能提高小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)細(xì)胞的存活率，增加腦組織谷胱甘肽水平，減少腦神經(jīng)元凋亡，降低MDA水平，抑制IL-1β與IL-6分泌，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；褪黑激素可提高創(chuàng)傷性腦損傷小鼠腦組織抗氧化酶SOD等的含量，抵抗氧化應(yīng)激傷害。Paul等[12]研究表明，褪黑激素可改善同型半胱氨酸所致PD大鼠的行為異常、多巴胺能神經(jīng)元丟失及氧化應(yīng)激，提高谷胱甘肽水平和抗氧化酶活性，以上文獻(xiàn)報(bào)道為本研究結(jié)論提供支持。

Fig 6 Effects of melatonin on expression of SIRT3 and its downstream proteins in substantia nigra of PD mice by Western blot n=4)

研究報(bào)道，褪黑激素通過(guò)上調(diào)SIRT3表達(dá)、提高SOD2活性抵抗心肌缺血/再灌注損傷[7]；還通過(guò)SIRT3-SOD2信號(hào)通路緩解膽汁酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激[13]。褪黑激素還可通過(guò)SIRT3-SOD2-ROS途徑促進(jìn)自噬，進(jìn)而減輕重金屬鎘誘發(fā)的肝臟毒性[14]。在缺血性卒中模型小鼠中，褪黑素通過(guò)激活SIRT1信號(hào)通路，減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞死亡[15]。本研究結(jié)果顯示，褪黑激素可通過(guò)上調(diào)SIRT3、SOD2基因表達(dá)，下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)，緩解MPTP所致多巴胺能神經(jīng)元損傷，作用機(jī)制與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致。

綜上所述，褪黑激素干預(yù)后，MPTP所致PD小鼠中腦黑質(zhì)TH表達(dá)增多、Iba-1表達(dá)減少，ROS與炎癥因子水平下降，SIRT3、SOD2基因表達(dá)上調(diào)，iNOS基因表達(dá)下調(diào)，結(jié)果表明，褪黑激素通過(guò)SIRT3-SOD2信號(hào)通路抵抗PD多巴胺能神經(jīng)元損傷，作用機(jī)制與其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，及減輕氧化應(yīng)激與炎癥損傷有關(guān)。

(致謝: 本實(shí)驗(yàn)是在玉林師范學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心和廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師的指導(dǎo)與幫助，另外還要感謝南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)室老師給予的幫助。)