薛 闖，杜廣慶

(大連理工大學 生物工程學院，遼寧 大連 116023)

1 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵

丙酮丁醇梭菌是嚴格厭氧的革蘭陽性菌，可以利用多種五碳糖和六碳糖作為碳源生產(chǎn)有機溶劑，包括丙酮、丁醇和乙醇，是目前研究最為廣泛的用于丁醇生產(chǎn)的工業(yè)微生物[1]。丁醇是一種重要的化工原料，也是極具潛力的可以替代石油的新型生物燃料[2]。生物丁醇的生產(chǎn)原料和生產(chǎn)工藝與乙醇相近，但是與乙醇相比，丁醇具有更明顯的優(yōu)勢。例如，丁醇具有與汽油相近的高能量密度，蒸汽壓低，腐蝕性小，與汽油混合時對水的寬容度大，并且能夠與汽油以更高的混合比混合，還可直接用于未經(jīng)改造的汽車發(fā)動機等，這些優(yōu)勢在能源利用上都具有重大意義[3]。近年來，由于石油價格波動和人們對環(huán)境污染問題的重視，以石油為原料生產(chǎn)丁醇的成本日趨增加，弊端也愈加凸顯，使得通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法重新受到關注[4]。微生物法生產(chǎn)丁醇主要是通過丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵法生產(chǎn)，發(fā)酵菌株主要包括丙酮丁醇梭菌(Clostrdiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)[5-8]。目前，ABE發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的主要問題是丁醇對梭菌細胞具有毒性抑制作用，使得發(fā)酵過程的產(chǎn)物濃度很低，進而導致后期的分離成本偏高，因此需要對現(xiàn)有的菌株進行改造來滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求[9]。丙酮丁醇梭菌ATCC 824作為丁醇生產(chǎn)的模式菌株，基因組已經(jīng)于2001年測序完成，其基因組由3 940 kb組成，并含有一個192 kb的大質(zhì)粒pSOL[10]。隨著基因組學和基因編輯技術的發(fā)展，丙酮丁醇梭菌基本的生理和代謝過程已經(jīng)被揭示，通過基因編輯和代謝工程來提高丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵性能(丁醇濃度，得率和生產(chǎn)強度)成為當前的研究熱點。本文對當前可用于丙酮丁醇梭菌分子改造的基因編輯工具進行了總結，并概述了利用基因編輯提高丙酮丁醇梭菌發(fā)酵性能的研究進展。

2 丙酮丁醇梭菌基因編輯工具

丙酮丁醇梭菌作為重要化學品和重要生物燃料丁醇的主要生產(chǎn)菌，受到學術界的廣泛關注。為實現(xiàn)生物丁醇產(chǎn)業(yè)化，對丙酮丁醇梭菌進行菌株改造是一項重要工作。近年來，隨著基因編輯技術的發(fā)展，越來越多的基因編輯工具應用于丙酮丁醇梭菌的分子改造過程。

1996年，Green等[11-13]利用自殺質(zhì)粒同源重組的方法，成功敲除了梭菌中的aad、pta、buk和solR基因。但是，這種方法的轉化率和重組效率很低，因此沒有應用到后續(xù)的研究中。1999年，Desai 和Papoutsakis利用反義RNA技術弱化丙酮丁醇梭菌中buk和ptb基因的表達，使得buk編碼的丁酸激酶和ptb編碼的磷酸丁酰轉移酶活性分別下降了85%和70%[14]。2002年，基于復制型同源重組實現(xiàn)基因敲除的方法得到發(fā)展，由于復制型質(zhì)粒在細胞中可以復制，增加了同源重組的概率，從而提高了轉化成功率，該方法成功用于spo0A基因的敲除[15]。2007年，基于II型內(nèi)含子的基因失活技術迅速發(fā)展，該方法的基本原理是位于乳酸菌ltrB基因的內(nèi)含子可在特定宿主中表達，然后通過自剪切脫離mRNA前體，與輔助蛋白LtrA結合后可識別并插入DNA的靶標序列，然后反轉錄合成互補鏈，進而以雙鏈DNA形式插入靶向位點，從而實現(xiàn)基因的插入型失活[16]。Minton教授團隊和姜衛(wèi)紅研究員團隊分別構建了適用于梭菌的內(nèi)含子插入型基因失活質(zhì)粒pMTL007和pSY6，在丙酮丁醇梭菌的分子改造中得到廣泛的應用[17-18]。II型內(nèi)含子基因失活技術雖然存在一定的局限性(需要靶標DNA插入位點具有特定的結構，并且內(nèi)含子可能插入非靶點基因，只適用于基因的插入失活，不能用于缺失型失活)，但是由于該方法操作簡單，轉化率高，內(nèi)含子片段插入目的基因的成功率高，使其仍然是丙酮丁醇梭菌中應用最為廣泛的基因編輯工具?；贑RISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術是近年來迅速發(fā)展的一系列基因編輯手段，由sgRNA引導，并通過Cas9、Cas9n及dCas9蛋白對基因組進行編輯或干預轉錄，廣泛應用于生物工程和生物醫(yī)學方面[19-20]。2016年，Li等[21]成功地利用CRISPR-Cas9技術將pyrE、adc和agrA基因中的20 bp片段分別更換為EcoRV、EcoRV和PstI限制性內(nèi)切酶識別序列，實現(xiàn)基因功能的缺失。Wasels等[22]將編碼Cas9蛋白的序列和gRNA序列分別連接到兩個不同的載體上，其中Cas9蛋白編碼序列源自于釀膿鏈球菌并經(jīng)過密碼子優(yōu)化，使用脫水四環(huán)素誘導啟動子表達，實現(xiàn)了在基因組上的單堿基替換、基因敲除和大片段的插入。目前為止，并沒有其他研究報道CRISPR-Cas9在丙酮丁醇梭菌的應用，主要原因是相對于II型內(nèi)含子基因敲除技術，CRISPR-Cas9更多地應用于真核生物中，在丙酮丁醇梭菌中的轉化率很低。

圖1 丙酮丁醇梭菌基因編輯工具的發(fā)展Fig.1 Development of genome editing tools for Clostridium acetobutylicum

3 丙酮丁醇梭菌的代謝工程改造

3.1 碳代謝途徑

在ABE發(fā)酵中，丙酮丁醇梭菌最常用的碳源為葡萄糖，可以將葡萄糖通過糖酵解途徑轉化為丙酮酸，然后丙酮酸通過中心碳代謝途徑轉化為有機酸和ABE溶劑。目前，對丙酮丁醇梭菌糖酵解途徑的基因研究較少，Ventura等[23]通過在丙酮丁醇梭菌ATCC 824中同時過表達糖酵解途徑的6-磷酸果糖激酶基因pfkA和丙酮酸激酶基因pykA，提高了細胞內(nèi)ATP和NADH的濃度和細胞對丁醇的脅迫耐性，從而使丁醇的產(chǎn)量提高了29.4%，在后續(xù)批次補料發(fā)酵過程中丁醇濃度可達到19.1 g/L。

木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的生物質(zhì)資源，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其水解產(chǎn)物主要有六碳葡萄糖和五碳木糖及阿拉伯糖[24]。在微生物發(fā)酵過程中能否利用纖維素水解后的混合糖是衡量發(fā)酵性能的一個重要指標，丙酮丁醇梭菌在發(fā)酵過程中雖然可以利用五碳糖中的木糖和阿拉伯糖，但是存在嚴重的碳分解代謝物阻遏作用(CCR)，即在混合糖發(fā)酵過程中優(yōu)先利用葡萄糖，并抑制其他碳源代謝相關的基因表達[25]。Gu等[26]在丙酮丁醇梭菌中過表達大腸埃希菌中的轉醛縮酶基因talA，改造菌株824-TAL在以木糖或以葡萄糖、木糖的混合糖為碳源的發(fā)酵中，木糖利用率和產(chǎn)溶劑能力均顯著提高。Ren等[27]發(fā)現(xiàn)分解代謝物控制蛋白CcpA與丙酮丁醇梭菌中的CCR效應相關，失活CcpA的突變菌株824ccpA可以有效解除CCR效應，同時利用混合糖中的葡萄糖和木糖，發(fā)酵終點丁醇濃度可以達到12.1 g/L。在后續(xù)研究中，Wu等[28]發(fā)現(xiàn)CcpA蛋白中第302位的纈氨酸是其行使蛋白功能的關鍵氨基酸，將該氨基酸替換為精氨酸后CCR效應減弱，木糖利用率提高，同時，組成sol操縱子的3個基因ctfA、ctfB和adhE1表達均上調(diào)。Bruder等[29]進一步闡述了CcpA的作用機制，CcpA蛋白復合體可結合到木糖代謝基因上游的CRE序列，抑制其表達，通過表達不含有CRE序列的木糖代謝基因可以將木糖的利用率提高7.5倍。Xiao等[30]發(fā)現(xiàn)參與磷酸葡萄糖轉移酶系統(tǒng)(PTS)的GlcG也與CCR效應相關，失活GlcG后的菌株在有葡萄糖存在的發(fā)酵條件下，可以同時利用木糖和阿拉伯糖，通過在GlcG失活菌株中過表達木糖代謝途徑的限速酶基因xylA、xylB和xylT，突變菌株對木糖和阿拉伯糖的利用率進一步提高。Jin等[31]在丙酮丁醇梭菌ATCC 824中過表達磷酸戊糖途徑中的4個關鍵酶基因，包括轉酮酶基因tal、轉醛酶基因tkl、核糖-5-磷酸異構酶基因rpe和核酮糖-5-磷酸差向異構酶基因rpi，提高了菌株對木糖的利用率，溶劑產(chǎn)量相對于野生菌株提高了42%。這些研究表明，丙酮丁醇梭菌經(jīng)過改造，可以實現(xiàn)同時利用木質(zhì)纖維素中的六碳糖和五碳糖，這是促進ABE發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化的一個重要方面。

3.2 中心代謝途徑

ABE發(fā)酵過程主要包括兩個階段：產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期。產(chǎn)酸期主要生產(chǎn)乙酸和丁酸。在產(chǎn)溶劑期，產(chǎn)酸期合成的乙酸和丁酸被重吸收用于合成丙酮、乙醇和丁醇[32]。直接對產(chǎn)酸和產(chǎn)溶劑途徑的基因進行改造是調(diào)控溶劑合成最簡單有效的方式。由ctfA、ctfB和adhE1基因組成的sol操縱子，直接負責丙酮丁醇梭菌中丁醇的合成，敲除其中任何一個基因，均造成丁醇產(chǎn)量顯著降低，乙酸和丁酸產(chǎn)量提高[33-35]。Mermelstein等[36]過表達由adc、ctfA和ctfB組成的ace操縱子，丙酮、丁醇和乙醇的產(chǎn)量與野生菌株相比分別提高了95%、37%和90%。Sillers等使用ptb強啟動子過表達adhE1基因，下調(diào)CoAT表達，在提高丁醇和乙醇產(chǎn)量的同時，降低了副產(chǎn)物丙酮的產(chǎn)量，最終總溶劑濃度達到30 g/L[37]。與丁醇合成直接相關的編碼醇醛脫氫酶的其他基因還包括adhE2、bdhA、bdhB和cap0059。阻斷adhE2、bdhA和bdhB基因表達對丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵產(chǎn)物沒有顯著影響，而阻斷cap0059基因表達，乙酸和丁酸產(chǎn)量降低，丁醇產(chǎn)量提高，其機理尚未明確[33]。由于有機酸積累會抑制菌株生長和ABE合成，一些研究通過阻斷有機酸合成途徑來調(diào)控溶劑代謝。Cooksley等[33]阻斷ack基因表達，乙酸產(chǎn)量降低，丁醇產(chǎn)量提高了23%，濃度達到8.6 g/L，而阻斷丁酸合成途徑基因ptb的表達，只有微量的丙酮和丁醇產(chǎn)量合成，同時乙醇產(chǎn)量大幅度提高。Jang等[34]阻斷有機酸代謝途徑基因pta、ptb和buk的表達，丁醇產(chǎn)量分別提高了46%、18%和22%，濃度分別達到了17.2、13.9和15.2 g/L。這些研究均表明阻斷有機酸的合成有利于丙酮丁醇梭菌的產(chǎn)溶劑代謝過程[38]。

丙酮是ABE發(fā)酵生產(chǎn)丁醇過程中最主要的副產(chǎn)物，消除副產(chǎn)物丙酮有利于提高丁醇的得率。丙酮合成途徑對碳源利用和有機酸重吸收有重要作用，直接阻斷adc基因的表達，有機酸重吸收過程被抑制，造成有機酸積累，丁醇產(chǎn)量降低[39]。Jiang等[40]在阻斷adc基因表達后，通過添加CaCO3和甲基紫精，在丙酮產(chǎn)量維持在微量的前提下，丁醇產(chǎn)量恢復到野生菌水平，同時乙酸濃度降低，最終丁醇在總溶劑中的比例提高至82%?？梢?，通過對代謝途徑基因進行改造，可以有效提高丁醇的比例和產(chǎn)量。然而，雖然通過外源添加CaCO3和甲基紫精可以彌補adc敲除菌丁醇產(chǎn)量降低的缺陷，但是由于添加物的成本問題，不利于丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)。Liu等[41]通過異源表達枯草芽胞桿菌中的乙偶姻合成途徑基因alsD和2,3-丁二醇合成途徑基因bdhA，在不改變丙酮合成途徑的前提下，將丙酮濃度降低到0.3 g/L，丁醇濃度從11.4 g/L提高到12.1 g/L，同時2,3-丁二醇濃度可以達到7.2 g/L，為減少副產(chǎn)物丙酮的合成提供了新思路。

3.3 丁醇脅迫耐性

ABE發(fā)酵終點丁醇濃度難以提高的一個限制性因素，是丁醇對細胞的毒害作用使得梭菌對丁醇的耐受濃度不到2%，主要原因包括丁醇進入膜后會改變細胞膜的流動性，降低了細胞內(nèi)的ATP濃度，影響了細胞對葡萄糖的吸收，因此提高發(fā)酵菌株對丁醇的脅迫耐性是提高丁醇產(chǎn)量的一個重要策略[42]。細胞膜的流動性與飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例相關，在ABE發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵產(chǎn)物丁醇濃度的增高，或者外源添加丁醇，細胞膜中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例均會提高[43]。Zhao等[44]在丙酮丁醇梭菌ATCC 824中過表達環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因cfa，改造菌對丁醇的耐受性大大提高，但是丁醇的產(chǎn)量降低。Bui等在含有丁醇合成途徑的大腸埃希菌中過表達參與脂肪酸合成的FabD編碼基因，提高了大腸埃希菌對丁醇的耐受性。雖然調(diào)控脂肪酸代謝基因的表達可以改善菌株對丁醇的耐受性，但是并不能提高丁醇產(chǎn)量[45]。丙酮丁醇梭菌響應丁醇脅迫的另一種方式是表達熱激蛋白，Tomas等[46]通過過表達熱激蛋白編碼基因groESL，總溶劑濃度相對于野生菌株提高了40%。Zingaro和Papoutsakis發(fā)現(xiàn)在1%丁醇脅迫條件下，過表達groESL的改造菌株在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，菌落數(shù)相對于野生型菌株增加了4倍[47]。在大腸埃希菌中異源表達丙酮丁醇梭菌的groESL基因，同樣可以提高菌株的丁醇脅迫耐性[48]。這些研究說明熱激蛋白GroESL不但與丙酮丁醇梭菌對丁醇的脅迫耐性相關，還參與調(diào)控丁醇的合成代謝。此外，Mann等[49]發(fā)現(xiàn)過表達熱激蛋白編碼基因grpE和htpG，菌株對丁醇的耐受性提高，但是丁醇產(chǎn)量沒有顯著變化，說明提高菌株對丁醇的脅迫耐性和提高丁醇產(chǎn)量并沒有必然的聯(lián)系。

3.4 孢子分化

丙酮丁醇梭菌是嚴格厭氧的革蘭陽性菌，在發(fā)酵過程中會分化出孢子，由于形成孢子的細胞不再具有溶劑代謝能力，阻斷孢子形成過程將有利于丁醇的生產(chǎn)[50]。Spo0A是丙酮丁醇梭菌中最重要的轉錄調(diào)控因子，Spo0A磷酸化后可啟動孢子形成，并同時啟動溶劑化形成[51]。Harris等[52]發(fā)現(xiàn)失活Spo0A的突變菌株SKO1基本不產(chǎn)溶劑，也不形成孢子，而過表達Spo0A編碼基因可加速孢子形成，誘導產(chǎn)溶劑相關基因提前表達，并提高脅迫耐性相關基因的表達，但是丁醇產(chǎn)量并沒有提高。后續(xù)研究集中于控制孢子形成的sigma因子和其他一些調(diào)控因子，以達到阻斷孢子分化且不影響丁醇合成的目的。Jones等[53]通過失活σF將孢子周期阻滯在細胞不對稱分裂之前，并將丁醇產(chǎn)量維持在野生型菌株水平。Tracy等[54]構建了σE和σG失活菌株，均有效地阻斷了孢子分化過程，且不影響溶劑合成，但是丁醇產(chǎn)量并沒有提高。Scotcher等[55]通過RNA干擾技術下調(diào)spoIIE基因的表達，延遲了孢子形成，并使丙酮、丁醇和乙醇的濃度相對于對照菌株分別提高了43%、110%和225%，說明可以通過抑制孢子形成進程來提高丁醇產(chǎn)量。解除孢子和溶劑合成關聯(lián)的另一個方法是以缺失大質(zhì)粒pSOL1的菌株(既不產(chǎn)孢子，也不合成溶劑)為出發(fā)菌，過表達丁醇合成途徑基因aad，使得缺失pSOL1的菌株可以合成與野生菌株等量的丁醇，而且由于丙酮合成途徑基因adc也在pSOL1上，該菌株可以在保持丁醇產(chǎn)量的前提下，不產(chǎn)生孢子，也不生產(chǎn)副產(chǎn)物丙酮，具有一定的優(yōu)越性[56]。雖然這些研究均成功地抑制了孢子生成，但是丁醇濃度均不超過12 g/L，仍然是ABE發(fā)酵最大的瓶頸。

由于通過改造受Spo0A調(diào)控的Sigma因子雖然可以阻斷孢子合成，但是并不能提高菌株的產(chǎn)溶劑能力，一些研究便開始集中于對Spo0A上游基因進行調(diào)控。由于Spo0A磷酸化后才能調(diào)控下游基因表達，Steiner等[57]研究了Spo0A的磷酸化途徑，發(fā)現(xiàn)組氨酸激酶Cac3319、Cac0323和Cac0903參與Spo0A磷酸化，Cac0437參與Spo0A的去磷酸化，通過失活Cac3319、Cac0323和Cac0903，孢子數(shù)量分別減少至野生菌的1%、4%和5%，而失活Cac0437，孢子數(shù)量增加了30倍，說明可以通過組氨酸激酶實現(xiàn)Spo0A磷酸化水平的調(diào)控，進一步調(diào)控孢子周期，但是該研究并未報道組氨酸激酶與丁醇合成的關系。然而，由于Spo0A直接參與溶劑合成的調(diào)控，Spo0A磷酸化水平的改變也被推測有可能調(diào)控丁醇合成。Xu等[58]通過比對經(jīng)過馴化的高產(chǎn)丁醇菌株JB 200(可合成丁醇～20 g/L)和出發(fā)菌株ATCC 55025的基因組發(fā)現(xiàn)，JB 200的組氨酸激酶Cac3319丟失一個氨基酸造成移碼突變，并經(jīng)研究表明通過II型內(nèi)含子基因敲除技術失活Cac3319后的突變菌株HKKO在ABE發(fā)酵中的丁醇濃度可以達到18.2 g/L，與JB 200基本接近，且對丁醇的脅迫耐性提高。Herman等[59]發(fā)現(xiàn)敲除多酮類物質(zhì)合成基因pks，可以抑制淀粉粒合成和孢子形成，同時提高丁醇產(chǎn)量。雖然該研究并未揭示其內(nèi)在機理，但是敲除pks和cac3319得到了類似的實驗結果，說明兩者可能存在內(nèi)在關聯(lián)。總之，通過改造Spo0A上游基因來實現(xiàn)對Spo0A磷酸化水平的精密調(diào)控，為同時提高ABE各項發(fā)酵性能提供了新的思路。

4 代謝工程改造存在問題

丙酮丁醇梭菌作為丁醇的主要生產(chǎn)菌株，丁醇產(chǎn)量相對較高，但是由于需要在厭氧條件下培養(yǎng)，其分子操作過程會更加繁瑣。Dong等[60]通過失活響應氧脅迫的抗性基因cac2634，提高了梭菌細胞的耐氧能力，并可實現(xiàn)在空氣中進行轉化操作，但是其轉化率要低于厭氧操作條件，說明空氣中的氧氣對菌株的存活仍然有負面作用。丙酮丁醇梭菌中存在Cac824I二型限制修飾系統(tǒng)，可以降解外源DNA入侵，保護自身DNA不被破壞，增加了丙酮丁醇梭菌基因改造的難度[61]。為了解決這一問題，Mermelstein等[62]利用含有枯草芽胞桿菌噬菌體Ф3TI甲基化酶的pAN1質(zhì)粒對需要轉化的質(zhì)粒進行甲基化修飾，可以防止外源質(zhì)粒被降解，實現(xiàn)質(zhì)粒的成功轉化，但是甲基化修飾延長了分子操作時間。Dong等[63]嘗試在丙酮丁醇梭菌中阻斷二型限制性內(nèi)切酶基因cac1502的表達，成功解除了限制修飾系統(tǒng)的限制，使外源DNA無需甲基化即可轉入梭菌中，這種方法也應用到后續(xù)的一些研究中。

迄今為止，用于梭菌的基因編輯技術主要有五種，其中基因敲除技術如自殺質(zhì)粒基因敲除，反義RNA干擾和復制型質(zhì)粒同源重組操作過程繁瑣且轉化率不高，而應用最為廣泛的II型內(nèi)含子基因敲除技術只能通過插入內(nèi)含子片段阻斷基因表達，并不能保證基因功能完全喪失?；贑RISPR-cas9系統(tǒng)的基因編輯技術雖然可以實現(xiàn)基因的整段刪除、替換和抑制表達等，但是在丙酮丁醇梭菌中的應用案例較少，基因操作不成熟，轉化率不高?？梢?，對丙酮丁醇梭菌的基因改造仍需要更簡單高效的基因編輯工具。

近年來，研究學者為了提高丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵性能，構建了很多性能優(yōu)良的發(fā)酵菌株，旨在提高發(fā)酵菌株的丁醇產(chǎn)量、丁醇在總溶劑中的比例以及丁醇的脅迫耐性，縮短發(fā)酵時間，阻斷孢子周期，使發(fā)酵菌株可在長時間連續(xù)培養(yǎng)模式中持續(xù)合成丁醇。但是由于缺乏對丙酮丁醇梭菌生理特性及整個ABE代謝過程的理解，丁醇產(chǎn)量始終不能大幅度提高，或者只能提高菌株的部分性能，例如阻斷孢子形成的菌株，丁醇產(chǎn)量均不超過～12 g/L，丁醇的生產(chǎn)強度不超過0.12 g/L/h，而對代謝途徑基因進行改造，丁醇產(chǎn)量可以提高至～18 g/L，但是由于孢子分化的影響，不能連續(xù)培養(yǎng)，這些均限制了實現(xiàn)丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)。而且，通過對丙酮丁醇梭菌進行各種定向的分子改造，所得突變菌株所能合成的最高丁醇濃度，均未能達到化學誘變菌株拜氏梭菌BA 101和馴化菌株丙酮丁醇梭菌JB 200發(fā)酵生產(chǎn)的丁醇濃度(～20 g/L)[64-65]。

5 展 望

迄今為止，通過ABE發(fā)酵生產(chǎn)生物丁醇已經(jīng)有100多年的歷史，由于原料價格高，丁醇轉化率低以及丁醇生產(chǎn)強度低，制約了丁醇發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。伴隨分子生物學技術的快速發(fā)展，丙酮丁醇梭菌的分子遺傳改造取得了很大進步，并且隨著代謝網(wǎng)絡模型、系統(tǒng)代謝工程、轉錄組學和蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展，丙酮丁醇梭菌的生理特性和代謝機理也被進一步揭示。今后對丙酮丁醇梭菌研究的重點將集中于以下幾個方面：①丙酮丁醇梭菌中有35個組氨酸激酶，目前只有參與Spo0A磷酸化和去磷酸化的5個組氨酸激酶功能被揭示，而其他組氨酸激酶的功能尚不明確，仍需研究丙酮丁醇梭菌中組氨酸激酶參與的雙組分系統(tǒng)功能，以及組氨酸激酶如何參與細菌中的細胞分裂、鞭毛運動、群體效應、孢子分化和產(chǎn)物代謝等多個過程，對這些組氨酸激酶進行系統(tǒng)研究將對了解丙酮丁醇梭菌的生理特性和代謝調(diào)控具有重要指導意義；②深入研究Spo0A對孢子分化和溶劑形成的作用機制，進一步研究如何通過調(diào)控Spo0A的轉錄水平和磷酸化水平來有選擇性的抑制孢子分化，促進丁醇合成；③優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高梭菌細胞活性、培養(yǎng)密度和對丁醇的耐受性，使得梭菌細胞可以在長時間的連續(xù)發(fā)酵中不自溶、不退化；④直接利用纖維素原料生產(chǎn)丁醇，丙酮丁醇梭菌中存在降解纖維素的纖維小體，但是活性很低，不能直接利用纖維素原料，通過合成生物學的方法提高丙酮丁醇梭菌降解纖維素的活性，將極大地降低原料成本，提高ABE發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的經(jīng)濟性。

總之，通過系統(tǒng)調(diào)控丙酮丁醇梭菌的生理和代謝，使其可以持續(xù)地將碳源轉化為丁醇，從而使微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物丁醇實現(xiàn)工業(yè)化。丁醇作為理想的石油替代品或者添加劑，隨著ABE發(fā)酵上游基因改造和下游過程工程技術的完善，將在生物燃料市場中發(fā)揮重要作用。