顧奕玥，胡澤平，王云飛，周 青，汪 淵

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一種多功能生長(zhǎng)因子，與其特異性受體(c-Met)結(jié)合后，通過激活相關(guān)信號(hào)通路在調(diào)節(jié)炎癥免疫等方面發(fā)揮重要功能[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是由炎癥介導(dǎo)的慢性血管疾病，AS斑塊中，巨噬細(xì)胞通過分泌大量促炎因子，使AS斑塊趨于不穩(wěn)定[2-3]。研究[4]表明，AS斑塊中的巨噬細(xì)胞因局部微環(huán)境的變化，可分化為經(jīng)典活化促炎的M1型和替代活化抗炎M2型。在不穩(wěn)定斑塊的脂質(zhì)核心M1型大量存在，促進(jìn)AS進(jìn)展；在穩(wěn)定型斑塊中M2型數(shù)量較高，促進(jìn)斑塊穩(wěn)定。調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化已成為抗AS治療的重要靶點(diǎn)。HGF和受體c-Met廣泛存在于心血管系統(tǒng)中，具有很強(qiáng)的抗炎作用。本課題組前期進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[5]結(jié)果表明：HGF促進(jìn)M2表型標(biāo)志物精氨酸酶Ⅰ(Arg Ⅰ)的表達(dá)，抑制M1表型標(biāo)志物一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，促進(jìn)斑塊穩(wěn)定、抑制AS進(jìn)展；HGF可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型向M2型轉(zhuǎn)化，但其具體分子機(jī)制并不明確。近年來研究[6-7]顯示，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)，作為HGF/c-Met軸的下游效應(yīng)因子，與M2型巨噬細(xì)胞極化和抗炎因子產(chǎn)生密切相關(guān)。該研究旨在探討HGF是否通過JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型向M2型極化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑RAW264.7細(xì)胞株為小鼠來源的巨噬細(xì)胞株，由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院贈(zèng)送。HGF、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)購自美國(guó)Peprotech公司；細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)購自美國(guó)Sigma公司；DMEM(高糖)培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Janus激酶2(JAK2)特異性抑制劑AG490購自美國(guó)Med Chem Express公司；iNOS、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、Arg Ⅰ、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、JAK2、STAT3、P-STAT3、β-actin抗體購自美國(guó)Sant Cruz Biotechnology公司；P-JAK2抗體購自美國(guó)abcam公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Griess reagents試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備無菌細(xì)胞操作臺(tái)(蘇凈安泰公司)；CO2/O2三氣水套式細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)(Thermo Scientific，美國(guó))；酶標(biāo)儀(1510，Thermo Scientific，美國(guó))；電泳儀、垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；制冰機(jī)(SCOTSMAN)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 37 ℃水溫復(fù)蘇RAW264.7細(xì)胞，用DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)，將細(xì)胞瓶置入飽和濕度37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞誘導(dǎo)和分組 未極化的RAW264.7巨噬細(xì)胞為M0對(duì)照組；IFN-γ(20 ng/ml)和LPS(500 ng/ml)誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞(M0型)12 h，使M0巨噬細(xì)胞極化呈M1型[8-9]，為M1組。不同濃度的HGF(5、10、20 ng/ml)干預(yù)巨噬細(xì)胞M1型12 h，為5M1組、10M1組、20M1組；50 μmol/L AG490和10 ng/ml HGF共同干預(yù)巨噬細(xì)胞M1型12 h，為AG490+10M1組。

1.3.3CCK8檢測(cè)法 取沖懸的RAW264.7巨噬細(xì)胞，按200 μl/孔(2×103個(gè)細(xì)胞)種于96孔板內(nèi)，按1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后分別給予0、0.1、0.5、2.5、5、10、15、20 ng/ml濃度HGF干預(yù)12 h。每孔加入10 μl的CCK8試劑，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上，450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值。

1.3.4培養(yǎng)上清液亞硝酸鹽濃度(NO%)的測(cè)定 分別收集M0、M1、5M1、10M1、20M1組細(xì)胞培養(yǎng)上清液。使用Griess reagents試劑盒檢測(cè)各組培養(yǎng)上清中亞硝酸鹽的分泌。使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在540 nm處讀取吸光度值。

1.3.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 上述方法分組處理好巨噬細(xì)胞后，用4 ℃的PBS清洗3次，每孔加入150 μl蛋白裂解液，靜置冰上30 min，充分裂解后刮取細(xì)胞蛋白存于1.5 ml EP管中反復(fù)凍融3次，4 ℃、14 000 r/min離心30 min棄除上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制SDS-PAGE凝膠，各組等量蛋白上樣、電泳分離，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，分別用TBST、TBS清洗PVDF膜一次，相應(yīng)的一抗(1 ∶1 000)孵膜，4 ℃過夜。TBST洗膜3次后用TBS洗膜1次，每次10 min。室溫孵育二抗(1 ∶5 000)2 h，TBST洗膜3次后用TBS洗膜1次，ChemiQ4600mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，β-actin為內(nèi)參，用 Quantity One系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0、GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用SNK-Q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HGF對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響用濃度在0～20 ng/ml之間的HGF預(yù)處理巨噬細(xì)胞12 h，與M0對(duì)照組比較，HGF對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞無增殖作用(F=1.868,P=0.13)。選用HGF(5、10、20 ng/ml)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 HGF對(duì)M1型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液亞硝酸鹽濃度的影響與M0對(duì)照組比較，M1組培養(yǎng)上清液亞硝酸鹽濃度明顯升高(F=7.129,P<0.05)。與M1組比較，各干預(yù)組培養(yǎng)上清液亞硝酸鹽濃度較干預(yù)前明顯下降(F=5.705,P<0.05)，見圖1。

圖1 HGF對(duì)巨噬細(xì)胞M1型培養(yǎng)上清液亞硝酸鹽濃度的影響

1：M0對(duì)照組；2：M1組；3：5M1組；4：10M1組；5：20M1組；與M0組比較：*P<0.05；與M1組比較：#P<0.05

2.3 HGF對(duì)M1型巨噬細(xì)胞M1、M2表型標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響與M0對(duì)照組比較，M1組巨噬細(xì)胞M1表型標(biāo)志物iNOS、IL-6蛋白表達(dá)顯著增加(F=3.326、316.529，P<0.05),見圖2A；M1組巨噬細(xì)胞M2表型標(biāo)志物Arg Ⅰ、IL-10蛋白表達(dá)明顯減少(F=22.515、33.832，P<0.05),見圖2B。與M1組比較，不同濃度HGF干預(yù)巨噬細(xì)胞M1型12 h后，各干預(yù)組M1表型標(biāo)志物iNOS、IL-6蛋白表達(dá)呈劑量依賴性減少(F=284.711、568.634，P<0.05)，見圖2A；各干預(yù)組M2表型標(biāo)志物Arg Ⅰ、IL-10蛋白表達(dá)呈劑量依賴性增加(F=431.018、1.302，P<0.05)，見圖2B。

圖2 HGF對(duì)M1型巨噬細(xì)胞M1和M2表型標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

2.4 HGF對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響與M0對(duì)照組比較，M1組JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白JAK2、STAT3磷酸化水平較低(F=6.283、30.863，P<0.05)，見圖3；與M1組比較，不同濃度HGF干預(yù)M1巨噬細(xì)胞后，各干預(yù)組JAK2、STAT3磷酸化水平明顯增強(qiáng)，呈劑量依賴性(F=130.709、22.480，P<0.05)，見圖3。使用JAK2特異性阻斷劑AG490 50 μmol/L與10 ng/ml HGF干預(yù)巨噬細(xì)胞M1型12 h后，與10M1組比較，AG490+10M1組M2表型相關(guān)蛋白Arg Ⅰ表達(dá)水平明顯下降(F=299.75，P<0.05)，見圖4。

3 討論

HGF最初因其在肝臟再生中的促分裂作用被發(fā)現(xiàn)和研究。這種多功能生長(zhǎng)因子由間質(zhì)細(xì)胞分泌，與其特異性受體c-Met結(jié)合后，通過激活相關(guān)信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)與遷移、抗凋亡、抗纖維化和調(diào)節(jié)炎癥免疫等方面發(fā)揮重要的功能。近年來研究[10]表明，HGF與受體c-Met結(jié)合，可促進(jìn)缺血心肌血管新生，并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮其復(fù)雜多效的抗AS作用。

圖3 HGF對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

1：M0對(duì)照組；2：M1組；3：5M1組；4：10M1組；5：20M1組；與M0組比較：*P<0.05；與M1組比較：#P<0.05

圖4 JAK2/STAT3通路被抑制后M2型相關(guān)蛋白表達(dá)

1：M0對(duì)照組；2：M1組；3：10M1組；4：AG490+10M1組；與M0比較：*P<0.05；與M1比較：#P<0.05；與10M1比較：△P<0.05

AS是一種慢性炎癥性疾病，AS斑塊中，巨噬細(xì)胞通過吞噬氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)形成泡沫細(xì)胞，并分泌大量促炎因子，導(dǎo)致斑塊脂質(zhì)核心增大，使AS斑塊趨于不穩(wěn)定。AS斑塊中的巨噬細(xì)胞，根據(jù)局部微環(huán)境的差異，可進(jìn)一步分化成不同的細(xì)胞亞型。并且，隨著微環(huán)境的變化，不同的細(xì)胞亞型之間，可以相互轉(zhuǎn)化，即為極化可塑性。目前，研究比較明確的巨噬細(xì)胞亞型包括經(jīng)典活化促炎的M1型和替代活化抗炎M2型。在動(dòng)脈粥樣斑塊中，M1型巨噬細(xì)胞增多時(shí)，生成和釋放促炎性因子(iNOS、IL-6等)，使斑塊穩(wěn)定性下降易于破裂，導(dǎo)致血栓形成，造成心血管事件的發(fā)生；當(dāng)M2型巨噬細(xì)胞增多時(shí)，分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等抑炎因子，可使斑塊纖維帽增厚，增加斑塊的穩(wěn)定性。因此，誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化可以抑制斑塊進(jìn)展，促進(jìn)斑塊穩(wěn)定。調(diào)控巨噬細(xì)胞極性可能成為臨床治療以AS為病理基礎(chǔ)的心血管疾病的新策略。

本研究中，LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞高度表達(dá)M1表型標(biāo)志物iNOS、IL-6，并大量分泌亞硝酸鹽。經(jīng)HGF干預(yù)后，M1表型標(biāo)志物iNOS、IL-6的表達(dá)和培養(yǎng)上清中亞硝酸鹽的釋放明顯降低，M2表型標(biāo)志物Arg Ⅰ、IL-10的表達(dá)明顯增加。這些結(jié)果表明HGF促進(jìn)M1向 M2表型極化。

JAK2是一種蛋白酪氨酸激酶，STAT3作為JAK2的直接底物，存在于細(xì)胞質(zhì)中并調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的表達(dá)[11-12]。JAK2對(duì)STAT3的磷酸化，促進(jìn)STAT3的核轉(zhuǎn)位，并激活M2巨噬細(xì)胞相關(guān)抗炎因子IL-10、Arg-1的表達(dá)[13-14]。M2型巨噬細(xì)胞中，STAT3信號(hào)通路的激活程度，遠(yuǎn)高于M1型巨噬細(xì)胞。有研究[15]表明，HGF/c-Met可激活下游效應(yīng)因子STAT3，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。本研究顯示，與M0對(duì)照組或M1組相比，HGF干預(yù)LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞后，可以顯著活化JAK2/STAT3信號(hào)通路。通過在HGF干預(yù)的M1型巨噬細(xì)胞中加入JAK2特異性阻斷劑，發(fā)現(xiàn)LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞(M1型)M2表型相關(guān)蛋白Arg I表達(dá)明顯降低。這表明抑制JAK2可阻斷HGF促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化和產(chǎn)生抗炎因子Arg I的能力。這些結(jié)果表明，HGF促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制可能與活化JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)。

體內(nèi)大部分巨噬細(xì)胞在復(fù)雜的微環(huán)境中是處于M1型和M2型之間的某個(gè)狀態(tài)。HGF促進(jìn)M1向M2表型極化，調(diào)節(jié)了M1/M2型巨噬細(xì)胞分化的比例，可能成為治療AS的新靶點(diǎn)。但HGF調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，是否還涉及其他分子機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。