司元純，張桂龍，王 丹，吳正巖，鄒多宏，陳喬爾

磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)造影劑是一類能夠增強局部軟組織圖像對比度的物質，T1造影劑主要通過改變水質子的自旋-晶格馳豫時間，使病灶組織圖像變的更亮，增強微小病灶與正常組織間的信號差異，為圖像診斷提供有力的影像信息[1-2]。臨床上應用的主要是T1造影劑，如二乙三胺五乙酸釓(gadolinium-diethylenetriaminepentaacetic acid,Gd-DTPA)。Gd-DTPA是一種小分子造影劑，其在體內代謝時間較短，難以獲得病灶組織的高分辨影像，且縱向弛豫率僅有4～5 mmol-1·s-1，遠遠未達到釓(gadolinium，Gd)離子的理論弛豫率，這為研究人員對高性能釓基納米造影劑的開發(fā)提供了巨大的提升空間[3-5]。該研究將具有順磁性的氧化釓(gadolinium oxide，Gd2O3)整合到比表面積大、生物兼容性好的介孔二氧化硅(silicon dioxide，SiO2)的表面，保證Gd與水分子的有效接觸，來產生更強的造影效果。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料十六烷基三甲基溴化胺(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)、三乙醇胺(triethanolamine，TEA)、正硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)購自上海阿拉丁公司；六水合氯化釓 (hexahydrated gadolinium chloride，GdCl3·6H2O)購自美國Sigma-Aldrich公司；細胞技術試劑盒(CCK-8)購自日本Dojindo公司。

1.2 儀器使用透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100F，日本JEOL公司)觀測樣品的形態(tài)；通過動態(tài)光散射粒度分析儀(DLS，Nanotrac Wave Ⅱ，美國Microtrac公司)檢測粒徑；孔隙率分儀(BET, Tristar Ⅱ，3020M，美國Micromeritics公司)測量樣品的氮吸附-脫附等溫曲線；采用X射線衍射儀(XRD，TTR-Ⅲ，日本Rigaku公司)分析晶體結構；使用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，iS10，美國Nicolet公司)檢測有機共價鍵；熱重分析儀(TGA, Q5000IR, 美國TA 公司)進行材料的熱重分析；通過電感耦合等離子體光學發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma optical emission spectrometer, ICP-OES，ICAP7200，美國Thermo Fisher Scientific公司)測定Gd離子濃度。

1.3 材料合成

1.3.1合成SiO2取50 ml錐形瓶，加入 2 g CTAB、20 μl TEA和20 ml超純水，在磁力攪拌下，升溫到80 ℃，保持此溫度20 min后，逐滴加入1.5 ml TEOS，反應4 h。12 000 r/min離心10 min收集，60 ℃鼓風干燥箱內烘干，瑪瑙研缽磨成粉，置于陶瓷坩堝中，在馬弗爐中600 ℃煅燒6 h，得到SiO2。

1.3.2合成不同梯度Gd2O3鑲嵌的SiO2另取5組50 ml錐形瓶，分別編號為②、③、④、⑤、⑥，分別加入2 g CTAB，20 μl TEA和20 ml超純水，在磁力攪拌下，升溫到80 ℃，保持此溫度20 min后，逐滴加入1.5 ml TEOS，反應4 h。然后，編號②、③、④、⑤、⑥的錐形瓶中，分別加入1 ml不同濃度(0 、0.001、0.01、0.1、0.5 g/ml)的GdCl3·6H2O溶液，繼續(xù)反應2 h，然后分別逐滴加入1 ml TEOS, 4 h后，12 000 r/min離心10 min收集。將上述6組離心產物分別收集至潔凈容器中，置于60 ℃鼓風干燥箱內烘干，使用瑪瑙研缽磨成粉，分別置于陶瓷坩堝中，在馬弗爐中600 ℃煅燒6 h，編號為②、③、④、⑤、⑥煅燒后得到的產物，分別命名為SG0、SG0.001、SG0.01、SG0.1、SG0.1和SG0.5。

1.4 SG0.1的結構表征將適量SG0.1超聲分散至無水乙醇中，再將混合溶液滴加到含有無定形碳膜的銅網上，烘干后放入到高分辨率投射電子顯微鏡中進行觀察，觀察SG0.1的形貌、尺寸和表面結構，X-射線能譜儀測量納米材料中Gd的相對含量。

1.5 SG0.1的馳豫率測定制備不同Gd濃度(0、4.375、8.75、17.5、35、70 μmol/L)SG0.1的瓊脂糖溶液封裝于2.0 ml離心管中，使用臨床磁共振掃描器(Sigma HDxt 3.0 Tesla MRI 系統(tǒng))，通過飽和恢復法自旋回波序列(回波時間=10 ms，脈沖時間=4 000、2 000、1 000、600、300、150 ms)獲取T1加權的磁共振圖像，并測得不同核磁管的縱向弛豫時間T1。使用ICP測定Gd離子濃度。通過縱向馳豫值的倒數/Gd離子濃度的線性擬合，來計算縱向弛豫率(longitudinal relaxation rate，r1)。

1.6 Gd離子泄露研究取SG0.1(5 mg)分別分散于含有pH為7.4、6.5、5.5、4.5和2.0 的4 ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)離心管中，另取SG0.1(5 mg)于10 ml試管中，加入2 ml濃硝酸和2 ml去離子水，在37 ℃水浴中靜置72 h，用高速離心機12 000 r/min離心10 min，隨后用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)檢測上清液中Gd離子的濃度。

1.7 細胞培養(yǎng)和細胞毒性測定將牙髓干細胞(dental pulp stem cell，DPSC)接種在96孔板中，應用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)DPSC，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。當細胞增殖融合達培養(yǎng)皿80%時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，然后將兩組DPSCs用不同濃度SG0.1分別處理24 h和48 h，除去培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細胞。使用CCK-8試驗測定細胞存活量。

2 結果

2.1 結構表征SiO2具有最高的比表面積，在加入TEOS后，比表面積降低了50%，隨著GdCl3·6H2O的添加量逐漸增大，比表面積逐漸增大，加入0.1 g時，比表面積最大，為661 cm3/g，繼續(xù)提高添加量，比表面積開始減小。見圖1A、1C。不同梯度的納米粒子，均具有明顯的介孔孔道結構，SiO2孔容積最大，隨著加入的GdCl3·6H2O劑量逐漸增大，納米粒子的介孔孔徑逐漸減小，直徑均小于4 nm，且孔容積逐漸降低。在添加不同GdCl3·6H2O濃度梯度中，SG0.1具有最高的比表面積，且在孔直徑為1.6 nm時，孔容積最大。見圖1B、1D 。

透射電子顯微鏡結果：合成后的納米粒子呈球形，粒度分布窄，尺寸均一，粒徑大小約50 nm, 具有明顯的孔道結構，SG0.1在50、20、5 nm尺度下，均可明顯看到Gd2O3納米點，白色圈標記的為超小Gd2O3，不具有晶格結構，為無定形形態(tài)。見圖 2。

X射線能譜圖，X射線能譜分析儀(energy dispersive spectrometer，EDS)展現出納米復合材料中存在明顯的Gd元素，直接說明了納米Gd2O3被成功整合在介孔硅中。見圖3A。材料中硅元素與Gd元素的相對含量見圖3B，Gd的相對質量占比為0.44%，原子百分比為0.08%。通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測得納米復合材料(SG0.1)中Gd元素的質量百分比為1.6%(5 mg SG0.1經50%硝酸消解72 h后，ICP測得的Gd離子含量為80 μg)。

動態(tài)光散射粒度分析儀檢測結果表明，SG0.1具有較窄的粒徑分布，水合粒徑約為200 nm，見圖4A，這些結果說明SG0.1在溶液中具有較好的穩(wěn)定性。X射線衍射結果顯示SG0.1中SiO2的吸收峰變弱，且沒有新的吸收峰出現，見圖4B，這說明整合在SiO2中的Gd2O3為無定形形態(tài)。傅里葉紅外結果顯示，SiO2和SG0.1在1 100 cm-1明顯的吸收峰和在1 150 cm-1～1 250 cm-1較弱的吸收帶歸屬于Si-O非對稱伸縮峰；在800 cm-1的吸收峰，屬于Si-O-Si對稱伸縮振動，在465 cm-1屬于Si-O彎曲振動；此外，2 850 cm-1和2 925 cm-1為C-H伸縮振動，1 470 cm-1為C-H鍵的彎曲振動，見圖4 C，說明SG0.1煅燒前含有有機物CTAB，而相應的峰位在煅燒后消失，表明CTAB被完全去除。熱重分析儀(thermal gravimetric analyzer, TGA)檢測結果見圖4D，通過TGA檢測SG0.1的水分和有機含量，測試溫度從室溫(20 ℃)開始，以20 ℃/min的升溫速率，升到820 ℃。SG0.1(煅燒前)熱重數據顯示，溫度小于200 ℃的重量損失主要由于水分子的損失(包含自由水和結合水)，失重量為2.28%，溫度在200～600 ℃之間的重量損失，主要是由于有機物模板劑(CTAB)煅燒分解產生的，失重量為43.17%，由此可知，煅燒前的產物中，有機物質量比為43.17%。600 ℃以后趨于平穩(wěn)。SG0.1(煅燒后)在小于100 ℃區(qū)段內，失重量為5.68%；200 ℃以后基本趨于平穩(wěn)，說明有機物在煅燒后已經完全去除。

圖1 不同氧化釓含量點綴的二氧化硅的比表面積及孔徑分布圖

A、B：分別為不同組份(SiO2、SG0、SG0.001、SG0.01、SG0.1及SG0.5)組合的氮氣吸附-脫附曲線圖和孔徑分布圖；C：上述各組份的比表面積柱狀圖；D：SG0.1的氮氣吸附-脫附曲線圖(Ⅰ)和孔徑分布圖(Ⅱ)

圖2 SG0.1在不同放大倍數下的透射電鏡圖

圖3 X射線能譜分析

圖4 SG0.1的材料表征

A：SG0.1的水合粒徑分布圖；B：SiO2和SG0.1的X射線衍射圖；C：SG0、SG0.1煅燒前和SG0.1煅燒后的紅外圖譜；D：SG0.1煅燒前和SG0.1煅燒后的熱重分析

2.2 SG0.1的馳豫率在場強為3.0 T的磁共振掃描器中，測得SG0.1縱向馳豫率r1為45.1 mmol-1·s-1，是Gd-DTPA的10倍(r1=4.2 mmol-1·s-1)，線性度高(R2= 0.99，R2是決定系數)，SG0.1的明暗圖表明隨著Gd離子濃度逐漸增加，T1加權圖像逐漸變亮，見圖5。這些數據均表明制備的SG0.1具有較高的磁共振造影性能。

圖5 SG0.1的磁共振性能表征

A: 1/T1-Gd濃度線性圖，計算SG0.1的縱向弛豫率；B:不同Gd離子濃度的明暗圖(場強3.0T)

2.3 SG0.1體外穩(wěn)定性研究溶酶體和核內體是細胞內酸性最強的細胞器，pH通常在4.5～6.5之間。SG0.1在pH≥4.5的磷酸鹽溶液中，Gd離子幾乎不泄露，即使pH 2.0磷酸鹽溶液中處理72 h，也僅有不到1%的泄漏，表明SG0.1具有極佳的酸穩(wěn)定性能。見圖6。

2.4 SG0.1的生物兼容性研究為了研究SG0.1的生物兼容性，通過CCK-8來評價其對細胞的毒性。

圖6 不同pH的磷酸鹽緩沖液中SG0.1的Gd3+釋放量

在培養(yǎng)時間為24 h及48 h時，不同濃度SG0.1與對照組(0 μg/ml)比較，進行單因素方差分析。24 h的數據中，細胞存活率較低的幾組數據(濃度為5 、10 、20 、40 μg/ml)與0 μg/ml單因素比較，細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義(F=2.640，P>0.05)。其他濃度組與對應0 μg/ml比較，細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義 (24 h：F=12.77，P<0.05; 48 h:F=12.07，P<0.05)，但細胞存活率增加而未降低。見表1、圖7。這些結果說明SG0.1納米造影劑具有很好的生物安全性。

表1 24 h和48 h細胞存活率

圖7 梯度濃度SG0.1與牙髓干細胞共培養(yǎng)24、48 h的細胞存活率

3 討論

磁共振成像技術具有無電離輻射、高空間分辨率、穿透深度不受限制等特點，已廣泛用于臨床診斷[6]。目前MRI檢查中，約有30%的檢查需要用到MRI造影劑來增強局部造影能力，而目前臨床使用的造影劑主要是Gd的螯合物(如Gd-DTPA、釓特酸葡胺)，由于這類Gd螯合物為小分子物質，在機體中代謝很快，為了達到肉眼可辨識的成像效果，需要加大造影劑的使用劑量，從而增加Gd離子泄露導致的風險(如腎纖維化)，特別是對于腎功能不全的患者更要慎用。研究[7-8]表明，相比于傳統(tǒng)小分子造影劑，納米造影劑在機體滯留時間較長，可以降低造影劑的使用劑量，易于功能化修飾，提高磁共振成像效果,因此眾多研究人員大力開發(fā)納米尺度(1～100 nm)造影劑。

造影劑本身不能產生造影信號，而是借助本身的磁學性質，通過與水分子的相互作用，間接改變病變部位與正常部位的氫質子的弛豫時間，使兩者差別化更為明顯，改變其信號強度，從而增強病變部位的圖像對比度。Gd3+最外層有七個單電子，具有最強的偶磁矩，因而成為MRI造影劑的主要研究對象[9-10]。

介孔SiO2具有較高的比表面積、穩(wěn)定介孔孔道、可調節(jié)的納米尺度、較高的藥物負載能力、易于表面修飾和良好生物兼容性等特點，氧化硅納米材料的商用產品已廣泛應用于臨床，因而，介孔SiO2被廣泛用于生物醫(yī)藥的研究[11-12]。Taylor et al[13]將Gd組裝到介孔SiO2介孔晶體材料(mesoporous crystalline material，MCM)MCM-41的孔道當中，利用介孔SiO2多孔的結構特點，使釓離子與孔道內的水分子充分接觸，改變周圍水質子的翻轉時間，提高縱向弛豫率。

本研究參考相關文獻，選擇相對尺寸適中，合成穩(wěn)定的介孔SiO2合成方法[14]，先合成出直徑大小為30 nm左右，具有2 nm左右的孔道結構，以此介孔SiO2納米粒子為內核，在反應混合溶液中，先加入GdCl3·6H2O，在堿性條件下(混合溶液的pH為9.0)，先形成氫氧化釓包覆于介孔SiO2的表面，再加入TEOS，將Gd2O3束縛于SiO2表層，烘干后又經過高溫煅燒，除去有機模板，氫氧化釓脫水變成Gd2O3，形成Gd2O3鑲嵌在介孔SiO2的表面。通過SiO2的多孔結構束縛水分子，延長水分子的滯留時間，增加Gd2O3與水分子的接觸時間，提高造影效果，本實驗合成和機制詮釋圖見圖8。

圖8 SG0.1的合成及機制詮釋

介孔SiO2的比表面積越大，其所能束縛水分子的能力越強，自由通過孔道進入的水分子也就越多，因而，表面Gd2O3接觸的水分子數量和時間也就越長[10]。通過探討5個梯度的GdCl3·6H2O添加量，顯示在添加量為0.1 g時，獲得的產物比表面積最大，孔道結構明顯。以SG0.1作為研究對象，并進一步對SG0.1的結構進行表征，檢測其MRI造影性能、穩(wěn)定性以及生物相容性。

本研究表明，SG0.1作為新型MRI造影劑，具有穩(wěn)定均一的納米結構，優(yōu)良的對酸穩(wěn)定性能，極佳的造影性能和生物兼容性，為未來潛在的臨床應用提供堅實依據。