宋 夢(mèng)，王多梅，汪 楓,2，周 青，汪 淵

晶狀體上皮細(xì)胞是位于晶狀體前囊膜最外層的單層細(xì)胞，在晶狀體的物質(zhì)代謝及損傷修復(fù)中發(fā)揮很大的作用，進(jìn)而影響整個(gè)晶狀體的通透性和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[1]。在日常生活中，晶狀體極易受到損傷，如紫外線照射、血糖增高、氧化反應(yīng)、藥物不良反應(yīng)以及年齡老化等原因均可能損害晶狀體上皮細(xì)胞的功能，導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生。微小核糖核酸micro RNA(miR)是長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈[2]。近期，miR-155作為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素出現(xiàn)，并且miR-155可以在不同細(xì)胞中調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)性信號(hào)通路基因的表達(dá)水平[3]。在日常生活中，糖尿病(diabetes,DM)是一種很普遍的疾病，在DM的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，其中晶狀體隨著時(shí)間延長(zhǎng)和病情加重會(huì)逐漸渾濁，進(jìn)而影響視力。該研究觀察miR-155對(duì)高糖誘導(dǎo)晶狀體渾濁的影響并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物及生長(zhǎng)環(huán)境 人晶狀體囊膜上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLEpiC)購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。20只普通級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(270±30)g，眼睛正常無損傷。實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)在適合環(huán)境中，溫度為20～27 ℃，相對(duì)濕度為50%～70%，正常作息光照，自由活動(dòng)飲水飲食。實(shí)驗(yàn)過程完全符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理?xiàng)l例》的規(guī)定。

1.1.2藥品及試劑 miR-155購(gòu)自上海GenePharma公司，-20 ℃保存；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)CLARK Bioscience 公司，-20 ℃保存，使用前室溫回溫；DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(DMEM培養(yǎng)基粉末一袋，谷氨酰胺0.58 g，丙酮酸鈉0.11 g，碳酸氫鈉3.7 g，青霉素160 U/ml，鏈霉素100 U/ml，溶于超純水中，混勻后定容至1 L，0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，儲(chǔ)存于4 ℃?zhèn)溆?；磷酸鹽緩沖液(PBS，無Ca2+、Mg2+)：稱取NaCl 8.0 g 、KCl 0.2 g、KH2PO40.2 g、Na2HPO42 g，超純水溶解混勻后定容至1 L，經(jīng)高溫高壓滅菌(121 ℃、20 min)，冷卻后放4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。二甲基亞?DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，無菌過濾嘴過濾后，1.5 ml EP管儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.25%胰酶：稱取0.25 g胰酶溶于PBS，磁力攪拌器攪勻后定容100 ml，過濾除菌，-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.1.3實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器 CO2/O2三氣水套式細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)和酶標(biāo)儀(1510)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；低速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；-80 ℃冰箱購(gòu)自日本sanyo公司；Milli-Q Direct-8純水儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；電泳儀和垂直電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠；制冰機(jī)(SCOTSMAN)和倒置、正置熒光顯微鏡(Leica DM3000B、DM4000)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；79-1磁力加熱攪拌器購(gòu)自常州杰瑞爾電器有限公司；電子天平：JY10001，JY2002、精密pH計(jì)PHS-3C型購(gòu)自上海雷磁儀器廠；安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科提供眼科手術(shù)器械。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物組織體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)最佳用藥濃度 取質(zhì)量相同范圍，狀態(tài)良好的SD大鼠，4只一籠，正常的適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后取材。10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉后將鼠仰臥固定，用手指抵住老鼠眼部，將眼球凸出，用剪刀將眼球剪下，用手術(shù)鑷子固定眼球，用眼科剪刀將眼球剪破，將晶狀體取出。取出晶狀體進(jìn)行體外培養(yǎng)，加藥處理，分組包括：低糖(low-glucose group, LG)培養(yǎng)基組、甘露醇組、高糖(high-glucose group, HG)培養(yǎng)基組、miR-155用藥組(mimic)、藥物對(duì)照組(control，CTm)。分別在48 h和72 h時(shí)收取凍存一份。

1.2.2細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和分組 凍存的HLEpiC在37 ℃溫水中快速?gòu)?fù)蘇，接種于7 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液。細(xì)胞長(zhǎng)到密度為80%～90%時(shí)，開始1 ∶3分瓶傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞和組織總蛋白的提取 采用Western blot法將不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，組織蛋白的提?。号渲屏呀庖?，根據(jù)每組晶狀體個(gè)數(shù)不同加入對(duì)應(yīng)體積的裂解液，一個(gè)晶狀體加500 μl，兩個(gè)加1 ml，記錄好。冰上充分研磨組織，研磨結(jié)束后的組織懸液直接放研磨器中置冰上30 min，使細(xì)胞充分裂解。用于BCA定量。HLEpiC細(xì)胞加藥處理后，冰上操作，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗3遍，每瓶加入配置好的裂解液200 μl，輕輕搖晃，使得裂解液覆蓋在細(xì)胞表面，冰上放置20 min；取出1.5 ml離心管做好標(biāo)記，冰上預(yù)冷；細(xì)胞刮刮下細(xì)胞層后，將細(xì)胞裂解液體吸入對(duì)應(yīng)離心管，冰上靜置30 min，-80 ℃、4 ℃反復(fù)凍融3次，于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清液至另一新EP管中，用于BCA定量。

1.2.4Western blot 配制聚丙烯酰胺凝膠，膠凝上樣跑膠。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜用具，裝制轉(zhuǎn)移“三明治”：海綿—3層濾紙—膠—PVDF膜—3層濾紙—海綿，整個(gè)操作在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后洗膜，放入其對(duì)應(yīng)的一抗中孵育，孵育條件為4 ℃垂直搖床孵育過夜或者更長(zhǎng)時(shí)間，一抗?jié)舛葹椋築ax(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶500)、caspase-3(1 ∶250)、procaspase-9(1 ∶500)，視情況而定。PVDF膜用TBST洗3次，TBS洗1次，每次8 min，放入其對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(鼠抗?jié)舛葹? ∶1 000，兔抗?jié)舛葹? ∶500)中孵育2 h，。PVDF膜從二抗中取出后，TBST洗3次，TBS洗1次，每次8 min，進(jìn)行機(jī)器顯影；ECL反應(yīng)液(A液和B液等體積混勻)現(xiàn)配現(xiàn)用，均勻涂在PVDF膜相應(yīng)條帶位置上。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù) 流式凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。取一瓶生長(zhǎng)至80%的HLEpiC細(xì)胞，消化離心，接種于6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。待細(xì)胞濃度長(zhǎng)到60%后，將mimic和CTm加到培養(yǎng)基中混勻后，分別加到不同的孔中處理48 h。將上清和消化的細(xì)胞一起離心，1 000 r/min離心7 min棄上清液，加入2 ml PBS重懸再次離心，重復(fù)1遍。傾去上清液，加入稀釋好的1×Annexin V buffer 100 μl重懸后，試管中加入核酸染料(7-amino-actinomycin D，7-AAD)與碘化丙啶(propidium iodide, PI)各2.5 μl混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。每孔加入400 μl Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白緩沖液(Annexin V buffer)混勻后，上機(jī)檢測(cè)，1 h內(nèi)完成。

2 結(jié)果

2.1 mimic對(duì)SD大鼠晶狀體蛋白中凋亡相關(guān)蛋白的影響用30 nmol/L的mimic和30 nmol/L的藥物對(duì)照CTm體外培養(yǎng)SD大鼠晶狀體48 h和72 h后收取組織，提取晶狀體總蛋白做Western blot實(shí)驗(yàn)，觀察不同處理組蛋白表達(dá)量的變化。48 h時(shí)，甘露醇僅作為大分子對(duì)照組，與高糖組比較，低糖培養(yǎng)組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯上升(F=59.721，P<0.05)，與高糖組比較，mimic作為miR-155的激動(dòng)劑，其抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯高于高糖培養(yǎng)組(F=37.313，P<0.05)，與高糖組相比，藥物對(duì)照CTm組Bcl-2表達(dá)量也呈上升趨勢(shì)(F=36.113，P<0.05)。而促凋亡蛋白Bax在高糖培養(yǎng)組中表達(dá)最多，與高糖組比較，在低糖組Bax表達(dá)明顯降低(F=33.09，P<0.05)且miR-155的激動(dòng)劑mimic組Bax表達(dá)量明顯減少(F=7.986，P<0.05)，提示高糖培養(yǎng)能夠促進(jìn)晶體細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而mimic能改變SD大鼠晶狀體蛋白中凋亡蛋白的表達(dá)。各組中caspase 3表達(dá)量趨勢(shì)與Bax表達(dá)量趨勢(shì)相同，而procaspase 9表達(dá)量趨勢(shì)與Bcl-2表達(dá)量趨勢(shì)一致。見圖1。72 h時(shí)，甘露醇僅僅作為大分子對(duì)照組。與高糖對(duì)照組比較，低糖培養(yǎng)組促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯下降(F=21.758，P<0.05)。高糖培養(yǎng)組的促凋亡蛋白Bax表達(dá)量明顯高于其他組，與高糖對(duì)照組比較，mimic作為miR-155的激動(dòng)劑，其促凋亡蛋白Bax表達(dá)量明顯降低，而其藥物對(duì)照CTm組Bax表達(dá)量也有下降趨勢(shì)(F=158.64，P<0.05)。而抗凋亡蛋白Bcl-2在高糖培養(yǎng)組中表達(dá)最少，與高糖對(duì)照組比較，在低糖組Bcl-2表達(dá)量明顯增加(F=664.424，P<0.05)且miR-155的激動(dòng)劑mimic組表達(dá)量明顯上升(F=38.809，P<0.05)，提示高糖培養(yǎng)能夠促進(jìn)晶狀體細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而mimic能改變SD大鼠晶體蛋白中凋亡蛋白的表達(dá)。見圖2。

2.2 mimic對(duì)HLEpiC凋亡的影響前期的晶狀體組織研究結(jié)果表明，當(dāng)用藥濃度為30 nmol/L時(shí)，mimic可以明顯抑制晶狀體凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。流式細(xì)胞術(shù)分組有雙標(biāo)組，其中雙標(biāo)組含有碘化丙啶(propidium iodide, PI)和異硫氰酸熒光素(fluoresceine isothiocyanate,FITC)；miR-155的激動(dòng)劑mimic組，mimic的藥物對(duì)照CTm組，低糖組，甘露醇組，高糖組。并且呈現(xiàn)同樣的結(jié)果，各組早期凋亡率(第四象限)和晚期凋亡率(第一象限)之和分別為1.091%、5.756%、6.320%、5.800%、6.381%、16.713%。低糖對(duì)照組凋亡細(xì)胞明顯很少，與低糖對(duì)照組相比，加藥組凋亡細(xì)胞比例無太大變化而高糖對(duì)照組早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例明顯增加，總凋亡的細(xì)胞數(shù)超過10%。見圖3。所有結(jié)果提示mimic用藥濃度為30 nmol/L時(shí)可以抑制HLEpiC細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3 mimic對(duì)HLEpiC中凋亡相關(guān)蛋白的影響用30 nmol/L的mimic和30 nmol/L的CTm處理HLEpiC細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞蛋白做Western blot實(shí)驗(yàn)，觀察不同處理組蛋白表達(dá)量的變化。48 h時(shí)，甘露醇作為大分子對(duì)照組，與高糖組相比低糖培養(yǎng)組procaspase 9表達(dá)明顯上升并且mimic作為miR-155的激動(dòng)劑，其procaspase 9表達(dá)量明顯升高(F=496.967，P<0.05)。而caspase 3在高糖培養(yǎng)組中表達(dá)最多，與高糖組相比，低糖組caspase 3表達(dá)量明顯減少(F=760.859，P<0.05)，并且miR-155的激動(dòng)劑mimic組caspase 3表達(dá)量明顯降低，提示高糖培養(yǎng)能夠促進(jìn)晶狀體細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而mimic能改變SD大鼠晶狀體蛋白中凋亡蛋白的表達(dá)。結(jié)果與組織蛋白的結(jié)果圖趨勢(shì)相同。見圖4。

圖1 miR-155對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響(48 h)

圖2 miR-155對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響(72 h)

A：Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)；B：caspase-3、procaspase-9蛋白表達(dá)；1：低糖組；2：甘露醇組；3：高糖組；4：mimic組；5：CTm組；與高糖組比較：*P<0.05

圖3 miR-155對(duì)HLEpiC細(xì)胞凋亡的影響

圖4 miR-155對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

A：Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)；B：caspase-3、procaspase-9蛋白表達(dá)；1：mimic組；2：CTm組；3：低糖組；4：甘露醇組；5：高糖組；與高糖組比較：*P<0.05

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)DM是損害包括眼睛在內(nèi)的全身性疾病。DM可以引起很多的并發(fā)癥，包括視網(wǎng)膜病變、腎病綜合征、神經(jīng)病變和高昂的醫(yī)療保健費(fèi)用[4]。DM患者與非糖尿病患者相比更容易得相應(yīng)的并發(fā)癥，DM患者與非糖尿病患者相比也更容易形成白內(nèi)障[5-6]。為進(jìn)一步研究糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制以及miR-155在治療白內(nèi)障過程中的作用。本文采用體外造模的方式，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期也相對(duì)較短，對(duì)于相似實(shí)驗(yàn)均可采用體外造模來驗(yàn)證。研究[7]顯示miR-155通過下調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞中抗氧化相關(guān)基因來誘導(dǎo)反應(yīng)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，所以進(jìn)一步驗(yàn)證其是否也可以影響晶狀體的抗氧化基因，進(jìn)而改變高糖對(duì)晶狀體的損害作用。研究[8]顯示葡萄糖濃度為20、30、40 mmol/L時(shí)，均可造成肺腺癌A549細(xì)胞DM相應(yīng)并發(fā)癥的現(xiàn)象，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇葡萄糖濃度為25 mmol/L來進(jìn)行體外造模實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果表明此濃度的葡萄糖培養(yǎng)基與低糖培養(yǎng)基相比可以促使HLEpiC細(xì)胞發(fā)生凋亡。

近年來miR-155也廣泛應(yīng)用于各個(gè)疾病治療中，研究[9]顯示miR-155在食物過敏小鼠模型中的作用，可以通過抑制miR-155的表達(dá)來抑制小鼠食物過敏的發(fā)生，表明miR-155對(duì)食物過敏有潛在的治療作用。也有研究[10]顯示內(nèi)源性miR-155控制死亡配體程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-Ligand 1,PD-L1)誘導(dǎo)上調(diào)γ-干擾素(γ-interferon,I FN-γ)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)的最大水平，在真皮纖維母細(xì)胞中也獲得了類似的發(fā)現(xiàn)，證明IFN-γ/TNF-α/miR-155/PD-L1通道并不局限于人皮膚淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，這些結(jié)果表明，miR-155在原發(fā)性細(xì)胞炎癥引起的炎癥反應(yīng)中起到了至關(guān)重要的作用。通過參考文獻(xiàn)，本文研究了miR-155對(duì)高糖誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的晶體是否有治療作用。

本文首先做晶狀體的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分別在48 h和72 h時(shí)提取組織蛋白，通過Western blot實(shí)驗(yàn)得出，高糖培養(yǎng)組在兩個(gè)時(shí)間段中，促凋亡蛋白的表達(dá)量均明顯高于其他組，并且加藥組能夠降低促凋亡蛋白的表達(dá)，提高抗凋亡蛋白的表達(dá)量。并且在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞分析以及Western blot實(shí)驗(yàn)中得到了相同的結(jié)果。

本課題目的在于研究miR-155是否抑制由高糖引起的晶狀體凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，通過組織實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別得到驗(yàn)證，miR-155濃度為30 nmol/L時(shí)，可以明顯地抑制高糖引起的晶狀體促凋亡蛋白Bax的表達(dá)以及促進(jìn)其抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，caspase家族蛋白caspase-3和procaspase-9也有相應(yīng)的變化，證明高糖可以促進(jìn)晶狀體凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。但miR-155是否對(duì)其他信號(hào)通路有影響尚且不明確，有待進(jìn)一步研究。