郭曉波，楊 樂，藺 京，龔衛(wèi)鋒，楊瑞利，史 敏

1.西安市中心醫(yī)院(西安 710003)；2.西安長安醫(yī)院(西安710018)；3.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院(西安710061)

骨髓增殖性腫瘤(Myeloproliferative, MPN)包括真性紅細(xì)胞增多癥，原發(fā)性血小板增多癥和原發(fā)性骨髓纖維化是起源于造血干細(xì)胞水平的克隆性血液惡性腫瘤。MPN發(fā)病機制的核心是由于影響JAK2，CALR或MPL的驅(qū)動突變家族的JAK / STAT信號傳導(dǎo)途徑的組成活化，炎癥因子被活化后可以引起紅系、巨核系異常增殖，網(wǎng)狀纖維異常增生，膠原蛋白過度沉積，從而又引發(fā)外周血細(xì)胞過度增生，骨髓纖維化和髓外造血等臨床表現(xiàn)[1]。這些疾病發(fā)病較為隱匿，進展緩慢，患者早期可能無任何臨床癥狀，僅在做血常規(guī)檢查時偶然發(fā)現(xiàn)，其具有共同的臨床和實驗室特征，是一系或多系統(tǒng)血細(xì)胞增多，肝脾腫大，有出血和血栓形成，發(fā)生動脈和靜脈血栓形成事件的風(fēng)險增加以及進展為骨髓纖維化和急性白血病的可能性，并且以血栓性并發(fā)癥的高發(fā)生率而聞名[2]。一些研究表明MPN發(fā)生血栓性并發(fā)癥與JAK2-V617F突變有很大的相關(guān)性[3]。本研究主要對MPN血栓事件發(fā)生率與JAK2-V617F等一些臨床指標(biāo)進行分析，探討引發(fā)血栓事件的危險因素，為臨床提供有益幫助。

資料和方法

1 一般資料 所有病例均來自本院就診住院MPN患者，其中男195例，年齡15～72歲，平均年齡56歲；女196例，年齡16～60歲，平均年齡48歲。391例病例的診斷均符合最新WHO關(guān)于骨髓增殖性腫瘤的分類和診斷的標(biāo)準(zhǔn)[4]。

2 儀器與試劑 JAK2-V617F采用美國伯樂CFX96實時熒光定量PCR儀，RNeasy Plus Mini Kit提取試劑盒購自德國GIAGEN公司，融合基因試劑盒(JAK2-V617F)購自上海源奇生物醫(yī)藥科技股份有限公司。血細(xì)胞分析儀采用邁瑞B(yǎng)C-5800，試劑為其公司試劑。

3 檢測方法

3.1 血常規(guī)外周血采集：所有對象從肘正中靜脈抽取靜脈血2ml置于EDTAK2抗凝管中，立即混勻，室溫2 h內(nèi)進行測定。標(biāo)本測定前需用標(biāo)準(zhǔn)血漿對血細(xì)胞儀進行室內(nèi)質(zhì)量控制，要求在控。在本研究當(dāng)之中主要是針對白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)以及血紅蛋白濃度值進行了對比分析。

3.2 JAK2-V617F融合基因標(biāo)本采集和檢測：采集患者外周血5.0m加入EDTAK2作為抗凝劑的一次性試管中，顛倒混勻，通過紅細(xì)胞裂解液除去標(biāo)本中的紅細(xì)胞(紅細(xì)胞破裂，液體呈紅色透明狀)，獲得白細(xì)胞，進而裂解白細(xì)胞和去除蛋白，用RNA提取試劑從中獲得RNA。將混有引物和熒光探針等物質(zhì)的PCR反應(yīng)液與酶混合，震蕩混勻5～10 s，在迷你離心機快速離心，從而將管壁和蓋子上的液體甩至管底。將上述液體放于PCR八連管中，隨后將提取好的樣本、內(nèi)參、陰陽對照、標(biāo)準(zhǔn)品分別加入對應(yīng)管內(nèi)，蓋緊管蓋、將其移至檢測區(qū)。反應(yīng)管置于實時熒光定量PCR儀上，按實際說明書要求設(shè)置相應(yīng)的循環(huán)參數(shù)：45℃×5min→95℃×3min，再按94℃×15s→60℃×60s，循環(huán)40次；單點熒光檢測在60℃；檢測通道為FAM通道。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定性分析，一般的Ct值可選擇在全部擴增曲線的第一個明顯拐點前2～3個Ct值，設(shè)定3～15個循環(huán)的平均熒光信號為基線(圖1)。全部實驗操作過程均嚴(yán)格按照試劑說明書和實驗室操作規(guī)范進行，同時做質(zhì)量控制，所有的結(jié)果均在實驗室質(zhì)量控制范圍內(nèi)。

注：Amplification為擴增曲線，Cycles為循環(huán)數(shù)，Log Scale為對數(shù)范圍

3.3 血栓性事件調(diào)查 通過經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)師對患者進行既往病史調(diào)查，詳細(xì)詢問并且記錄每一位患者既往有無心、腦血栓性疾病以及出現(xiàn)和MPN擬診相關(guān)臨床征象后的深靜脈血栓形成和心、腦梗死等血栓性事件發(fā)生的情況。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用[例(%)]表示，計量資料比較采用χ2檢驗。以發(fā)生血栓事件為因變量，各項記錄指標(biāo)為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 MPN血栓事件發(fā)生率的情況 391例MPN患者中105例發(fā)生血栓事件，血栓發(fā)生率為26.9%(105/391)。血栓發(fā)生率在男女性別之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.59，P>0.05)；而年齡≥45歲的患者高于年齡<45歲的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.81，P<0.05)；JAK2-V617F陽性的患者高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.59，P<0.05)；外周血白細(xì)胞數(shù)量≥10×109/L的患者高于白細(xì)胞<10×109/L的患者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=28.3，P<0.05)；外周血血小板數(shù)量≥300×109/L的患者高于血小板數(shù)量<300×109/L的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.14，P<0.05)；外周血血紅蛋白含量≥160g/L的患者高于血紅蛋白含量<160g/L的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=30.58，P<0.05)。見表1。

表1 MPN血栓事件發(fā)生率情況

2 Logistic回歸分析 采用多因素Logistic回歸分析方法，以年齡、性別、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白、JAK2-V617F陽性為自變量，以血栓為因變量，結(jié)果顯示：高齡、高白細(xì)胞計數(shù)、高血小板計數(shù)、高血紅蛋白含量、JAK2-V617F突變陽性是血栓事件發(fā)生的危險因素，見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

討論

骨髓增殖性腫瘤患者的整個發(fā)病的過程中出現(xiàn)的所有并發(fā)癥以及繼發(fā)血液系統(tǒng)癌癥,是對這一類患者的生存質(zhì)量有非常大的影響。由于這一類患者外周血中的細(xì)胞增殖速度過快、量過高，以至于引起外周血液粘稠、淤滯，進而又引起心腦血管方面的各種疾病，心腦血管血栓和出血事件是這一類患者出現(xiàn)并發(fā)癥以及于導(dǎo)致此類患者死亡的最主要原因之一。2016年新的骨髓增殖性腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)中，JAK2-V617F基因突變檢測被納為診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，真性紅細(xì)胞增多癥患者JAK2-V617F基因突變的檢出率為90%～95%，原發(fā)性血小板增多癥患者JAK2-V617F基因突變的檢出率為50%～70%，原發(fā)性骨髓纖維化患者JAK2-V617F基因突變的檢出率為40%～50%。JAK2-V617F基因突變不僅與骨髓增殖性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，而且與其并發(fā)癥和預(yù)后也有很大關(guān)系，有研究表明，JAK2-V617F基因突變可以增加費城染色體陰性MPN患者心血管并發(fā)癥的風(fēng)險[5]。同時也有研究表明JAK2-V617F突變與血栓事件的發(fā)生率之間存在顯著的相關(guān)性，JAK2-V617F內(nèi)皮細(xì)胞有促炎癥和促血栓表型和功能上都是親粘附，提示這些突變可能在血栓形成中發(fā)揮作用[6-8]。Lamy M等國外研究者在其研究結(jié)論中，認(rèn)為篩選在CVT患者JAK2 -V617F突變似乎即使沒有明顯的MPN和/或由于其患病率比較高的其他危險因素CVT的存在和血栓復(fù)發(fā)的危險性是有益的[9]。

本文從MPN患者性別、年齡、JAK2-V617F、外周血常規(guī)方面，分別比較其血栓事件的發(fā)生率，結(jié)果顯示MPN患者男女性別之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而高年齡、JAK2-V617F陽性、高白細(xì)胞數(shù)量、高血小板數(shù)量、高血紅蛋白含量的患者更易出現(xiàn)心腦血管血栓事件。本研究還進一步通過回歸分析顯示，高年齡、高白細(xì)胞計數(shù)、高血紅蛋白含量、高血小板計數(shù)、JAK2-V617F突變等因素與MPN發(fā)生血栓事件有關(guān)，是發(fā)生血栓事件的危險因素。此次研究結(jié)果中，JAK2-V617F陽性患者血栓發(fā)生率為80%，陰性患者血栓發(fā)生率為20%，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)果與土耳其研究者Andlc Neslihan 的研究結(jié)果有相似之處[10]。國內(nèi)研究者吳鴻飛等[11]人回顧性分析了115例bcr-abl陰性的骨髓增殖性腫瘤患者初診時的臨床特征和實驗室指標(biāo)，最終認(rèn)為JAK2-V617F陽性、高HB水平、高血壓、高齡是發(fā)生血栓的危險因素，這一結(jié)果中有些觀點與本文研究結(jié)論相一致。

血栓是骨髓增殖性腫瘤患者主要致死和致殘的原因之一，所以預(yù)防和治療血栓發(fā)生是治療這一類疾病的主要目的。目前臨床上主要的治療方法有小劑量阿司匹林降低原發(fā)性真性紅細(xì)胞增多癥和原發(fā)性血小板增多癥患者的血栓發(fā)生，針對原發(fā)性真性紅細(xì)胞增多癥的放血療法，羥基脲、干擾素α降低血細(xì)胞的方法。對于原發(fā)性血小板增多癥的患者可以適當(dāng)?shù)牟捎每鼓齽┧幬镏委焷矸乐寡ǖ陌l(fā)生。原發(fā)性骨髓纖維化患者主要是激素、沙利度胺、骨化三醇、糾正其貧血等手段為主，如遇到早期血細(xì)胞高的患者可以加羥基脲進行治療[12]。近年來JAK2抑制劑[13-14]等一些新型靶向藥物的研究有望對JAK2-V617F陽性的患者帶來更多選擇和新的曙光。對于本研究當(dāng)中引發(fā)骨髓增殖性腫瘤患者血栓事件的危險因素，臨床及早的采取一些預(yù)防和治療措施，可以幫助患者提高生活質(zhì)量和延長生存期。

綜上所述，血栓形成在癌癥患者中很常見，并與發(fā)病率和死亡率增加有關(guān)，骨髓增生性腫瘤(MPN)最重要的并發(fā)癥是血栓栓塞事件，因此預(yù)防血栓形成事件是目前這些疾病治療的主要目標(biāo)。年齡較高、JAK2-V617F陽性、血細(xì)胞升高的MPN患者容易出現(xiàn)血栓事件，是其發(fā)生血栓事件的危險因素，提示臨床對于這些指標(biāo)的變化應(yīng)該引起高度重視，及早采取預(yù)防措施。