馮雨嘉，蔣佳志，晏 鑫，郭梓鑫，李 勝，孟詳喻，陳 松

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長趨勢[1]。盡管治療手段多樣且不斷改進，但復(fù)發(fā)率仍較高，尤其肌層膀胱癌和轉(zhuǎn)移性膀胱癌的預(yù)后更差，近十年治療未取得重要進展[2]。

驅(qū)動蛋白家族成員2C(kinesin family member 2C，KIF2C)，也叫分裂著絲粒相關(guān)驅(qū)動蛋白(mitotic centromere associated kinesin,MCAK)，是驅(qū)動蛋白家族-13中最具代表性的成員，參與微管的解聚、二極紡錘體的形成和染色體的分離，從而對有絲分裂和細胞周期進行調(diào)節(jié)。KIF2C可以使細胞間期中微管的穩(wěn)定性降低，抑制KIF2C可以導(dǎo)致多種動點-微管附著缺陷，動點-微管的連接異?？梢詫?dǎo)致非整倍染色體細胞的產(chǎn)生。此外，KIF2C表達水平的降低或缺失將導(dǎo)致有絲分裂S期染色體的排列異常和G2期染色體的錯誤分離，從而破壞正常的有絲分裂進程，這些都被認為是誘發(fā)腫瘤的潛在原因[3]。但是，KIF2C基因在膀胱癌中的表達研究報道較少。

本研究通過收集美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因表達匯編(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫的公共數(shù)據(jù)集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，分析KIF2C在膀胱癌中的表達情況，探究KIF2C與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系，并使用基因集富集分析(gene sets enrichment analysis,GSEA)的方法預(yù)測在膀胱癌細胞中可能受KIF2C調(diào)控的基因集，為進一步研究KIF2C在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供線索和思路。

1 資料和方法

1.1 資料 從GEO數(shù)據(jù)庫中下載基因表達譜數(shù)據(jù)集，選取標(biāo)準(zhǔn)為包含KIF2C表達數(shù)據(jù)的人類膀胱癌和正常膀胱組織的表達譜。數(shù)據(jù)集GSE13507[4]使用Illumina公司的Illumina human-6 v2.0 expression beadchip基因表達芯片，該數(shù)據(jù)集包含了165例原發(fā)性膀胱癌和10例正常膀胱組織的基因表達譜及性別、年齡、TNM分期等臨床信息。在GSE13507數(shù)據(jù)集中篩選了膀胱癌患者和正常膀胱組織的KIF2C基因表達譜數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息。使用GSE13507數(shù)據(jù)集用于GSEA分析。在數(shù)據(jù)集GSE13507中，KIF2C基因?qū)?yīng)的探針為ILMN_1685916。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)分組 對樣本數(shù)據(jù)集GSE13507做回顧性研究和生存期分析，排除其中臨床資料缺失的樣本，根據(jù)表達譜數(shù)據(jù)對樣本的KIF2C的表達進行由高到低排序后，取前50%的樣本為高表達組(n=82)，后50%的樣本為低表達組(n=83)。

1.2.2 挖掘樣本富集基因 采用GSEA3.0版本[5]進行分析。GSE13507被納入GSEA。膀胱癌組織樣本根據(jù)KIF2C的表達水平被分為高表達組和低表達組后，通過GSEA分析KIF2C的表達水平對各種生物通路基因集的影響。GSEA網(wǎng)站的MsigDB數(shù)據(jù)庫中獲得的基因集作為參照基因集，按照默認加權(quán)富集統(tǒng)計(GSEA說明詳見http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)的方法，每次隨機重復(fù)1 000次進行分析。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理及作圖 統(tǒng)計學(xué)處理以及作圖分別使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5軟件。使用兩獨立樣本t檢驗的方法進行膀胱癌細胞與正常膀胱組織細胞中基因表達差異的比較。臨床病理相關(guān)性分析中，組間比較采用聯(lián)列表法和χ2檢驗。進行生存分析時，使用Log-rank(Mantel-Cox)法比較KIF2C高表達與低表達組的生存期，以P<0.05為差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義。在GSEA中，P<0.05及錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates,FDR)<0.25的基因集作為顯著富集基因集。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和正常膀胱組織中KIF2C的表達 在膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，KIF2C在正常膀胱組織中低表達(7.390±0.043，n=10)，在膀胱癌組織中高表達(8.959±0.086，n=165)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.000 1，圖1)。

圖1 膀胱癌組織和正常膀胱組織中KIF2C的表達

2.2 KIF2C表達水平與膀胱癌的臨床病理相關(guān)性 在膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，疾病是否進展(P=0.009)、疾病分級(P=0.000)、T分期(P=0.000)、N分期(P=0.013)與KIF2C的表達差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義；M分期與KIF2C的表達差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.687，表1)。

2.3 KIF2C與膀胱癌患者的預(yù)后相關(guān)性 在膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，KIF2C高表達組和低表達組的5年腫瘤特異性生存率分別為67.986%和92.203%(Log-rank=13.030，P=0.0003，HR=0.2743，95%CI：0.1359～0.5537，圖2A)；5年總生存率分別為50.969%和70.538%(Log-rank=9.217，P=0.0024，HR=0.4700，95%CI：0.2887～0.7652，圖2B)。

2.4 KIF2C高表達的基因集富集 用GSEA方法分析KIF2C的表達水平對各種生物通路基因集的影響，使用基因集“oncogenic gene sets”作為參照基因集，GSEA的結(jié)果顯示KIF2C高表達的樣本富集了與核糖體蛋白質(zhì)、多梳蛋白、內(nèi)源性核糖核酸酶、E2F轉(zhuǎn)錄因子、抑癌基因RB有關(guān)的基因集(表2)。

表1 KIF2C表達水平與膀胱癌的臨床病理相關(guān)性

注：N分期KIF2C高表達組有1例數(shù)據(jù)刪失

圖2 膀胱癌患者生存曲線

基因集富集分數(shù)FDRP值RPS14dn.v1dn-0.75120.0128<0.0001PRC2EZH2up.v1up-0.70420.0092<0.0001E2F1up.v1up-0.70140.0089<0.0001E2F3up.v1up-0.69210.0114<0.0001CSRlateup.v1up-0.73270.0108<0.0001Rbp130dn.v1up-0.64000.01130.0020GCNPSHHupearly.v1up-0.68550.02460.0021

3 討論

驅(qū)動蛋白包括一個巨大的馬達蛋白超家族，它最初是1985年在魷魚神經(jīng)細胞大軸突內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的，主要存在于真核細胞內(nèi)。驅(qū)動蛋白在有絲分裂中起著重要作用，這啟發(fā)人們思考通過抑制驅(qū)動蛋白的生物學(xué)功能來抑制腫瘤的生長，以此作為治療癌癥的手段。通過破壞驅(qū)動蛋白的軌道—微管蛋白[6]，可以有效的對癌癥進行控制和治療。目前微管蛋白抑制劑(microtubule inhibitor,MTI)已經(jīng)可以成功地抑制有絲分裂，達到阻礙癌細胞增殖的效果。

KIF2C/MCAK(染色體1p34)是驅(qū)動蛋白家族中最具特征的成員[7]，以往的研究表明KIF2C對紡錘體組裝和確保有絲分裂過程中染色體的分離起著重要作用[8-10]，KIF2C的過表達可以抑制染色體不穩(wěn)定的細胞系中細胞染色體的分離錯誤[11]。在有絲分裂過程中，KIF2C還在維持遺傳完整性方面起著重要的作用。有研究表明KIF2C基因的表達水平與增殖細胞核抗原(Ki-67)密切相關(guān)[12]，Ki-67是一種與細胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)，是目前多種惡性腫瘤研究中的熱門生物指標(biāo)，可以通過Ki-67抗原的檢測了解惡性腫瘤的細胞增殖活性。多項惡性腫瘤研究表明，KIF2C過表達可能與乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤的進展有關(guān)[13-16]，這可能與非整倍體的形成有關(guān)[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)KIF2C在膀胱癌組織中較正常膀胱組織表達上調(diào)，提示KIF2C的表達與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。類似的結(jié)果在結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、頭頸癌和乳腺癌中也有發(fā)現(xiàn)。Gnjatic等[16]研究顯示，KIF2C在結(jié)腸癌細胞系和結(jié)直腸癌患者的惡性組織中表達上調(diào)，在胃癌、胰腺癌、頭頸癌和乳腺癌中均有表達上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)KIF2C可能是多種癌癥主動免疫治療的靶點之一。Duan等[18]研究表明，腫瘤組織中的KIF2C表達有望作為男性食管鱗狀上皮細胞癌患者的獨立預(yù)后標(biāo)志。Shimo等[14]研究表明，KIF2C在乳腺癌組織中高表達，并且可能在乳腺癌細胞的細胞分裂中扮演重要的角色，此研究還通過cDNA微陣列數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了在胰腺癌和膀胱癌中，KIF2C/MCAK都有表達上調(diào)，提示KIF2C高表達組膀胱癌患者的臨床病理特征(如疾病進展，腫瘤分級，T分期，N分期)明顯差于KIF2C低表達組的患者，說明KIF2C的高表達與膀胱癌的惡性程度及疾病進展密切相關(guān)。GESA分析揭示其機制可能是，高表達KIF2C通過調(diào)節(jié)細胞周期(內(nèi)源性核糖核酸酶、E2F轉(zhuǎn)錄因子)、細胞增殖(多梳蛋白、抑癌基因RB)和細胞蛋白質(zhì)合成(核糖體蛋白質(zhì))相關(guān)的基因集，影響膀胱癌細胞的增殖和代謝進而推動膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究生存期分析提示KIF2C高表達的患者術(shù)后生存期更短、復(fù)發(fā)更快，KIF2C有望成為評估膀胱癌預(yù)后的標(biāo)志物之一。本研究的局限性和啟示：①由于數(shù)據(jù)集樣本量的限制，未來實驗研究需擴大樣本量、嚴格分組來進一步驗證；②KIF2C調(diào)控這些信號通路的作用機制還不十分清楚，是否為膀胱癌患者臨床預(yù)后的獨立危險因素，還有待更深入的機制研究加以驗證。

綜上所述，KIF2C可通過多種途徑來促進膀胱癌細胞的增殖和分裂，進而影響膀胱癌患者的臨床預(yù)后。因此，KIF2C有希望成為診斷膀胱癌的標(biāo)志物或潛在治療靶點，這為未來的臨床研究提供了新的思路。