武廣珩 ，王東曉 ， 傅仙玉 ， 趙家儒 ，聶云春 ，李國平

(1.武夷學院生態(tài)與資源工程學院，武夷山 354300； 2.福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術重點實驗室，武夷山 354300；3.武夷學院茶與食品學院，武夷山 354300）

茶赤葉斑病是茶園成葉、老葉常見病害之一，我國各主要產(chǎn)茶省均有報道，發(fā)生普遍，局部地區(qū)發(fā)生嚴重[1]。該病的發(fā)生特點是病斑面積大，傳播速度快，嚴重干擾茶樹正常的生理代謝，特別是光合作用，大大減少了樹體內(nèi)有機物質(zhì)的積累[2]。茶赤葉斑病已發(fā)現(xiàn)致病菌為茶生葉點霉（Phyllostictatheicola），屬半知菌亞門真菌，且對不同茶樹品種侵害存在差異[3]。近年來，對于茶赤葉斑病的病原報道較少，尚未發(fā)現(xiàn)其他致病菌。本文通過對引起武夷巖茶赤葉斑病的病原菌進行鑒定、形態(tài)觀察和rDNA-ITS序列分析，以期確定茶赤葉斑病的病原菌，為該病害的防治提供治理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 癥狀觀察及病菌采集

2017年7月至8月，在福建省南平市武夷學院茶學系實驗茶園內(nèi)觀察發(fā)現(xiàn)茶赤葉斑病，記錄并拍下茶赤葉斑病的病害癥狀，采集病害嚴重且仍有韌性的水仙品種茶葉。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)

參考張小芳等[4]用無菌手術刀切取葉片病健交界部位5 mm×5 mm的小片組織，先用75% 的酒精浸泡45 s，再用無菌水重復沖洗3次后，無菌吸水紙吸干水分。于無菌研缽中，加入適量無菌水及無菌石英砂進行研磨，組織研磨后靜置10 min。用接種環(huán)蘸取研磨靜置溶液，分別接種于純PDA培養(yǎng)基、PDA茶汁液培養(yǎng)基（茶汁液為采摘新鮮茶葉150 g剪碎，加入1 000 mL蒸餾水煮沸30 min后過濾得到的濾液[5]；其中，純PDA培養(yǎng)基未加入茶汁，PDA茶汁液培養(yǎng)基則是吸取100μL、150 g/L茶汁液涂布在PDA培養(yǎng)基上）。將培養(yǎng)皿倒置于溫度為25℃、光照為4 800 Lux的光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 病原菌純化

培養(yǎng)72 h，挑取生長旺盛的菌絲進行菌種劃線培養(yǎng)，待菌絲生長較多時再挑取菌絲點在平板中央，讓其長滿整個平板，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測定

1.4.1 離體葉片接種

根據(jù)韋潔玲之前報道的接種方法[6]，并做部分修改。在產(chǎn)孢茂密的培養(yǎng)基中加入適量無菌水清洗，將整皿的分生孢子洗下，加入0.2%的吐溫20℃，搖勻，過濾得到孢子懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)后，用無菌水調(diào)整為1×108個/mL，制備成供試孢子懸浮液。摘取健康茶樹新梢的嫩葉、近平展著生的二三葉[7]，用75%的酒精擦拭消毒，用無菌水沖洗后晾干。將茶葉置于PDA培養(yǎng)基上，用接種針蘸取孢子懸浮液于茶葉上分別均勻打3～4個孔完成接種，接種8片茶葉。以接種無菌水為對照。接種完成后，置于25℃、4 800 Lux的光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，定期觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4.2 染色與拍照

按照接種后天數(shù)收集接種病菌的葉片置于Trypan Blue染液 （20 mL乙醇，10 mL苯酚，10 mL超純水，10 mL 83% 乳酸和10 mg臺盼藍粉末）中煮沸15～20 min；染色后的葉片用水合三氯乙醛（2.5 g/mL）過夜脫色至半透明狀；用超純水洗滌后用50%甘油保存[8]。使用顯微鏡觀察拍照。

1.5 病原菌形態(tài)學觀察

用無菌接種環(huán)挑取平板上純化后的菌體制片，在正置熒光顯微鏡（Leica DM2500）下觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征，并進行拍攝。根據(jù)病原菌的形態(tài)及菌落形成特征，參考相關資料進行病原菌鑒定。

1.6 病原菌分子鑒定

1.6.1 病原菌DNA的提取

從貯存的PDA茶汁培養(yǎng)基上刮取足量的菌絲和孢子，加入液氮研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒 （天根生化科技有限公司，DP130227）說明書進行DNA的提取。將收集到的DNA溶液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 rDNA-ITS序列測定和序列分析

采用真菌通用的引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和 ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對病菌進行PCR擴增。PCR反應體系為：2×Tap MasterMix 25 μL，ITS1 和 ITS4 各 2 μL，模板 DNA 1μL，RNase-Free Water加至 50 μL。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，52℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min；16℃保存。取5μL PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，隨后PCR產(chǎn)物送至生工生物工程 （上海）股份有限公司測序。將測序結果通過GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比對，用MEGA 7軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

赤葉斑病一般5-6月開始發(fā)病，7-8月為發(fā)病高峰期，該病害主要危害嫩葉、成葉[9]。赤葉斑病在武夷學院茶園水仙葉片的發(fā)病初期，多從葉尖或葉邊緣開始產(chǎn)生淺褐色病斑，病斑面積較?。▓D1A），后擴展到半葉或全葉，形成不規(guī)則的、面積較大的赤褐色病斑，病斑邊緣具有深褐色隆起線，病健交界明顯（圖1B），后期病斑上生有許多黑色隆起的細小粒點（圖1C）。

圖1 武夷巖茶水仙葉片赤葉斑病發(fā)病情況Figure 1 Disease symptom of red leaf spot disease in nature

2.2 病原菌的致病性測定

為了確認分離純化的病原菌為茶赤葉斑病的致病菌，我們進行致病性實驗。在離體葉片上人工接種分離的病原菌，接種的葉片均有發(fā)病，發(fā)病率為100%，對照組均未發(fā)病（圖2A）。接種后3 d（圖2B）出現(xiàn)淺褐色病斑，5 d病斑逐漸增大，顏色加深，7 d病斑擴展減慢，10 d病斑呈赤褐色（圖2C）。該表型類似于上述武夷學院茶園水仙茶樹葉片所觀察的茶赤葉斑病表型。

將感染病菌的茶葉經(jīng)Trypan Blue染色液染色，脫色液過夜脫色處理后，置于顯微鏡下觀察。結果發(fā)現(xiàn)，病菌大多數(shù)生長在柵欄組織內(nèi)，接種后3 d孢子已經(jīng)萌發(fā)菌絲（圖2D、2E）。孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲數(shù)量與長度隨接種后天數(shù)逐漸增加（圖2F、圖2G），生長到一定程度后，菌絲和孢子梗相互纏繞形成分生孢子器（圖2H）。病斑上形成的黑色粒點即病菌的分生孢子器，黑色，有孔口，呈球形或近球形（圖2I）。之后，此接種發(fā)病茶葉經(jīng)再分離、再純化獲得的菌株與原接種的菌株形態(tài)特征及菌落特點一致，獲得了相同的病原菌，符合柯赫氏法則。上述結果證明，原接種的菌株為茶赤葉斑病的致病菌，我們將其命名為CCYB1。

圖2 接種病原菌葉片表型Figure 2 The symptoms of CCYB1 on the inoculated leaves

2.3 病原菌的培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

將茶赤葉斑病菌CCYB1在不同培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，如表1所示培養(yǎng)3 d后觀察到病菌在涂抹了100μL茶汁液的培養(yǎng)基上生長情況較好，培養(yǎng)基孢子萌發(fā)率為50%，而無涂抹的培養(yǎng)基孢子萌發(fā)率為0。結果表明，涂抹茶汁液更易于茶赤葉斑病菌孢子的萌發(fā)。

表1 茶汁對CCYB1病原菌的孢子萌發(fā)的影響Table 1 Effect of tea juice on spore germination of CCYB1

將菌株CCYB1純化后的孢子在PDA茶汁培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)5 d即長滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿。菌絲生長初期為白色絨狀，產(chǎn)孢后逐漸變黑（圖3A）；生長后期平板菌落整體呈黑褐色，邊緣有白色菌絲體（圖3B），菌落反面為黃色（圖3C）。將菌體制片，在顯微鏡下觀察孢子的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)分生孢子呈紅褐色至褐黑色，單胞，呈圓形或橢圓形，兩端內(nèi)凹，且孢子四周光滑或稍粗糙（圖3D）。

圖3 CCYB1在生長情況和分生孢子形態(tài)Figure 3 The culture characteristics and morphology of CCYB1

2.4 病原菌的分子鑒定

通過對病原菌CCYB1的rDNA-ITS基因片段進行PCR擴增，獲得一段603 bp片段（圖4）。將測序得到的序列提交到GenBank（登錄號：MG279093）。利用BLAST進行同源性比較，結果顯示分離的病原菌與塔賓曲霉（Aspergillustubingensis）的相似度達100%。構建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖5），分離的病原菌與Aspergillus tubingensis （KT803072.1、KP994290.1、KF434096.1 、KF434094.1、KF434093.1）聚在同一分支。再根據(jù)之前所觀察的CCYB1菌落特征，查詢中國微生物與病毒主題數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與數(shù)據(jù)庫中塔賓曲霉相關特征吻合。綜合上述病原菌的形態(tài)特征和分子鑒定結果，最終確認CCYB1是塔賓曲霉。

圖4 CCYB1病原菌rDNA-ITS的PCR擴增Figure 4 PCR amplification of rDNA-ITSof CCYB1

圖5 N-J算法構建進化樹Figure 5 Neighbor-joining phylogenetic tree based on rDNA-ITSgene sequences

3 結論與討論

國內(nèi)外關于茶赤葉斑病的研究較少，我國的報道主要側重于病害的發(fā)生規(guī)律、病害與葉片結構的關系以及病害防治方法，未見有涉及病原菌鑒定的詳細資料。茶赤葉斑病已報道的致病菌為茶生葉點霉（Phyllosticta theicola），屬半知菌亞門真菌[3]。

本研究分離純化的CCYB1，通過致病性測定和rDNA-ITS序列的比對分析，發(fā)現(xiàn)作為茶赤葉斑病致病菌的CCYB1是塔賓曲霉 （Aspergillus tubingensis）。塔賓曲霉屬半知菌亞門，半知菌綱，殼霉目，杯霉科，菌落在25～37℃均可生長。我們所發(fā)現(xiàn)的CCYB1特征是具有黑褐色菌落，較長的分生孢梗柄和較小的分生孢子，分生孢子呈紅褐色至褐黑色，近球形，表面稍粗糙，上述特征與中國微生物與病毒主題數(shù)據(jù)庫內(nèi)的描述一致。

之前的研究尚未發(fā)現(xiàn)自然狀況下塔賓曲霉危害茶葉的現(xiàn)象。本研究中的塔賓曲霉CCYB1經(jīng)離體葉片針刺法接種致病菌，發(fā)現(xiàn)CCYB1可以侵染武夷巖茶水仙葉片，產(chǎn)生的赤褐色病斑，與田間茶赤葉斑病發(fā)病類似。2017年有報道發(fā)現(xiàn)，塔賓曲霉能夠使小桐子染上葉斑病，同時還發(fā)現(xiàn)對環(huán)境的適應力可能與寄主小桐子的生長環(huán)境以及葉片的生理生化性質(zhì)有關[10]。塔賓曲霉CCYB1的發(fā)現(xiàn)，為深入研究茶赤葉斑病的致病機理研究和田間防治提供了理論參考。

以往的研究還發(fā)現(xiàn)，塔賓曲霉能夠對環(huán)境中一定濃度的Pb2+起到固定作用[11]；能夠通過優(yōu)化發(fā)酵條件，對類黑精和蜜糖酒精廢水有一定的脫色作用[12]；對聚氨基甲酸酯具有生物降解作用[13]。結合上述研究，塔賓曲霉CCYB1在工業(yè)生產(chǎn)和廢棄物循環(huán)利用方面具有實際應用的可能性，為今后環(huán)境治理提供了更多的菌種選擇。