馬 敬,郭金寶,錢(qián)俊勇,仇繼兵

(江蘇省常州市第三人民醫(yī)院,江蘇 常州 213001)

放射性治療所致聽(tīng)力神經(jīng)損傷是頭頸部腫瘤放射性治療后最常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一[1]，其發(fā)病率高，且目前臨床尚無(wú)特效治療藥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。銀杏葉提取物(EGB)主要有效成分為銀杏萜內(nèi)酯類化合物和銀杏黃酮類[2]，因其具有生物利用度高、毒性弱、治療多靶點(diǎn)、療效顯著、代謝完全等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的預(yù)防及治療方面[3]。研究表明，EGB可明顯減輕鼻咽癌患者放射性治療期間內(nèi)耳損傷程度，推測(cè)EGB具有防護(hù)放射線對(duì)中耳損傷的作用，但其作用機(jī)制尚未闡明[4]。目前，國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)EGB對(duì)放射性損傷耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1影響的研究?；诖?，本研究探討了EGB761對(duì)放射性損傷耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1增殖、凋亡及細(xì)胞存活素(Survivin)、Bcl-2家族前凋亡蛋白(Bax)表達(dá)的影響，旨在為EGB應(yīng)用于臨床放射性聽(tīng)力神經(jīng)損傷治療提供一定理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1，由美國(guó)豪斯耳研究所提供。

1.1.2主要試劑與儀器 EGB761，購(gòu)于德國(guó)威瑪舒培博士藥廠，生產(chǎn)批號(hào)1710711；高糖DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清，購(gòu)自杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于碧云天生物研究所；瓊脂糖，購(gòu)于法國(guó)Biowest公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit，購(gòu)于日本TaKaRa公司；CO2培養(yǎng)箱，購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，購(gòu)于美國(guó)BD公司；紫外分光光度計(jì)，購(gòu)于美國(guó)Beckman公司；qRT-PCR儀ABI7700，購(gòu)于美國(guó)ABI公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1細(xì)胞接種于含體積百分?jǐn)?shù)10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于10% CO2培養(yǎng)箱中33 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)，整個(gè)過(guò)程中均未添加任何抗生素，以免影響耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1細(xì)胞生物學(xué)特性。

1.2.2細(xì)胞照射與分組處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEI-OC1細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)研究，分別設(shè)置正常對(duì)照組、放射性損傷組及10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L EGB761干預(yù)組。除正常對(duì)照組為正常未經(jīng)照射處理細(xì)胞，其他各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞均進(jìn)行照射處理，放射源VARIAN 2300EX直線加速器6 MV X線，100 cm源皮距，照射劑量率4 Gy/min，照射劑量20 Gy。干預(yù)組分別加入含有相應(yīng)濃度EGB761的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組、放射性損傷組給予等體積DMSO作為對(duì)照。

1.2.3HEI-OC1細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEI-OC1細(xì)胞增殖能力，消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，按1.0×105個(gè)/mL接種于96孔板，分別于24 h、48 h、72 h、96 h加入20 μL濃度為5 g/L的MTT，繼續(xù)孵育4 h，離心去上清，每孔加入200 μL DMSO終止反應(yīng)，震蕩10 min后，采用酶聯(lián)免疫分析儀，于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定樣本吸光度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4HEI-OC1細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用胰酶消化制成HEI-OC1細(xì)胞懸浮液，離心并收集細(xì)胞，采用PBS洗滌液洗滌HEI-OC1細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀(FCM)，按照標(biāo)準(zhǔn)程序檢測(cè)HEI-OC1細(xì)胞凋亡率，具體操作嚴(yán)格按照儀器及試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5Survivin、Bax表達(dá)水平檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，經(jīng)PBS液洗滌后，采用Trizol法分別提取HEI-OC1細(xì)胞總RNA，所提RNA無(wú)DNA、蛋白質(zhì)殘留，純度較高。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，所得cDNA用以作為qRT-PCR反應(yīng)模板。qRT-PCR反應(yīng)選用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit定量擴(kuò)增體系，反應(yīng)總體積10 μL：cDNA 0.8 μL，SYBR Primix Ex Taq 5 μL，引物1.2 μL，RNase H2O 1.8 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。以β-action為內(nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果采用2-ΔΔCT方法處理，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CTβ-action)觀察組-(CT目的基因-CTβ-action)對(duì)照組。引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 擴(kuò)增引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組HEI-OC1細(xì)胞增殖比較 與正常對(duì)照組比較，放射性損傷組HEI-OC1細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05)；與放射性損傷組比較，10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L EGB761干預(yù)組HEI-OC1細(xì)胞增殖能力明顯上升(P均<0.05)，且呈一定劑量依賴性。見(jiàn)圖1。

圖1 各組HEI-OC1細(xì)胞增殖能力比較

2.2各組HEI-OC1細(xì)胞凋亡率比較 正常對(duì)照組、放射性損傷組以及10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L EGB761干預(yù)組HEI-OC1細(xì)胞凋亡率分別為(2.62±0.23)%，(9.06±0.37)%，(7.45±0.32)%,(5.29±0.28)%,(4.17±0.33)%和(2.93±0.24)%。與正常對(duì)照組比較，放射性損傷組HEI-OC1細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；與放射性損傷組比較，10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L EGB761干預(yù)組HEI-OC1細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P均<0.05)，且呈一定劑量依賴性。

2.3各組HEI-OC1細(xì)胞中Survivin、Bax表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，放射性損傷組HEI-OC1細(xì)胞中Survivin表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，Bax表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與放射性損傷組比較，10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L EGB761干預(yù)組HEI-OC1細(xì)胞中Survivin表達(dá)水平明顯升高(P均<0.05)，Bax表達(dá)水平明顯下降(P均<0.05)，且呈一定劑量依賴性。見(jiàn)圖2及圖3。

注：A、B、C、D、E、F分別代表正常對(duì)照組、放射性損傷組和10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L EGB761干預(yù)組；①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05；③與C組比較，P<0.05；④與D組比較，P<0.05；⑤與E組比較，P<0.05。

圖2 各組HEI-OC1細(xì)胞中Survivin表達(dá)水平比較

注：A、B、C、D、E、F分別代表正常對(duì)照組、放射性損傷組和10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L EGB761干預(yù)組；①與A組比較，P<0.05；②與B比較，P<0.05；③與C組比較，P<0.05；④與D組比較，P<0.05；⑤與E組比較，P<0.05。

圖3 各組HEI-OC1細(xì)胞中Bax表達(dá)水平比較

3 討 論

放射性治療是臨床上治療頭頸部腫瘤的常用手段，尤其是鼻咽癌患者，放射性治療是其根治性治療的唯一手段[5]。放射物理學(xué)技術(shù)及放射生物學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展，使得頭頸部腫瘤患者生存率有了明顯提高，但在鼻咽癌放射治療過(guò)程中，耳部各個(gè)部分幾乎全部暴露于放射視野內(nèi)，導(dǎo)致耳道炎、慢性化膿性中耳炎、分泌性中耳炎、顳骨壞死等多種耳部并發(fā)癥發(fā)生[6-8]。因此，放射性治療后腫瘤患者生存質(zhì)量受到廣泛關(guān)注，在放療過(guò)程中如何防護(hù)放射線對(duì)耳部正常部位損傷，是目前臨床亟待解決的關(guān)鍵性問(wèn)題。

近年來(lái)，中藥以其安全性高、治療多靶點(diǎn)、毒性小的優(yōu)點(diǎn)在抗癌臨床上得到了廣泛應(yīng)用[9]，發(fā)掘新的有效中藥活性成分是目前疾病治療的潛在策略。EGB761是目前我國(guó)臨床上使用最為廣泛的中藥材提取物之一，其主要有效成分為銀杏萜內(nèi)酯類化合物和銀杏黃酮類[10]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分及其藥理作用進(jìn)行廣泛研究，證實(shí)其具有抗炎、保護(hù)缺血損傷、調(diào)血脂、擴(kuò)張血管、抗腫瘤以及拮抗血小板活化因子等重要藥理作用[11-13]，在臨床心腦血管、腫瘤等多種疾病治療方面療效確切。施雨露等[14]研究結(jié)果顯示，EGB可明顯降低X射線照射小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率，發(fā)揮抗輻射作用。姜梁等[15]研究結(jié)果表明，EGB可通過(guò)擴(kuò)張耳部血管，中和及清除機(jī)體自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化作用，從而減少豚鼠中耳早期放射性損傷，且EGB不良反應(yīng)少，性質(zhì)穩(wěn)定，推薦臨床鼻咽癌等頭頸部腫瘤患者放療時(shí)使用?；诖耍狙芯刻接懥薊GB761對(duì)放射性損傷耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1增殖、凋亡及Survivin、Bax表達(dá)的影響，旨在為EGB應(yīng)用于臨床放射性聽(tīng)力神經(jīng)損傷治療提供更為可靠的理論參考依據(jù)。

本研究MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，放射性損傷組HEI-OC1細(xì)胞增殖能力明顯下降；與放射性損傷組比較，EGB761干預(yù)組HEI-OC1細(xì)胞增殖能力明顯上升，且呈一定劑量依賴性。說(shuō)明20 Gy照射劑量明顯降低HEI-OC1細(xì)胞增殖能力，經(jīng)不同劑量EGB761干預(yù)后HEI-OC1細(xì)胞增殖能力明顯上升，提示EGB761可明顯逆轉(zhuǎn)照射所致HEI-OC1細(xì)胞增殖能力下降，發(fā)揮防輻射作用。FCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，放射性損傷組HEI-OC1細(xì)胞凋亡率明顯增加；與放射性損傷組比較，EGB761干預(yù)組HEI-OC1細(xì)胞凋亡率明顯降低。提示EGB761可逆轉(zhuǎn)輻射損傷所致HEI-OC1細(xì)胞凋亡，提高HEI-OC1細(xì)胞存活率。宋媛媛等[16]研究結(jié)果顯示，EGB可明顯拮抗輻射所致大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活率降低，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輻射損傷，支持本研究觀點(diǎn)。Survivin是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因[17]，在細(xì)胞周期中可呈現(xiàn)周期依賴性表達(dá)，可在G2/M周期明顯高表達(dá)，抑制細(xì)胞下游執(zhí)行細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3及Caspase-7活化[18]，從而有利于細(xì)胞增殖及分化。Bax為凋亡活化基因[19-20]，是Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)基因家族重要成員之一，可與Bcl-2基因共同調(diào)節(jié)線粒體凋亡過(guò)程[21-22]。qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，放射性損傷組HEI-OC1細(xì)胞中Survivin水平明顯下降，Bax水平明顯升高，經(jīng)EGB761干預(yù)HEI-OC1細(xì)胞中Survivin水平明顯升高，Bax水平明顯下降，推測(cè)EGB761可通過(guò)上調(diào)Survivin基因表達(dá)，從而促進(jìn)Survivin對(duì)Caspase-3活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，另一方面下調(diào)Bax基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制HEI-OC1細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)HEI-OC1細(xì)胞放射性損傷作用。

綜上所述，EGB761可明顯促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞增殖，抑制HEI-OC1細(xì)胞凋亡，推測(cè)其作用機(jī)制可能為上調(diào)凋亡抑制基因Survivin表達(dá)及下調(diào)凋亡促進(jìn)基因Bax表達(dá)。本研究仍存在研究指標(biāo)較少等不足之處，僅在細(xì)胞增殖及凋亡方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，EGB761在逆轉(zhuǎn)放射性損傷領(lǐng)域的臨床應(yīng)用價(jià)值，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究充分驗(yàn)證。