王朝輝 辛永寧

1.青島大學(xué) (山東 青島， 266071) 2.青島市第六人民醫(yī)院肝病科 3.青島市市立醫(yī)院消化科

肝細(xì)胞癌(HCC)是國(guó)內(nèi)比較常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其不僅具有較高的發(fā)病率，還有很高的死亡率，對(duì)人們的生命健康造成了很大的威脅。國(guó)內(nèi)乃至全球，每年都有大量的患者死于肝癌，因此肝癌的發(fā)病機(jī)制和臨床治療方案一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)[1，2]。 原發(fā)性肝癌具有病程進(jìn)展迅速、復(fù)發(fā)率高且轉(zhuǎn)移侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)，而且HCC的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，醫(yī)學(xué)界截止目前仍未能完全精準(zhǔn)的對(duì)其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等機(jī)制作出定論，這些都導(dǎo)致HCC在臨床治療中的效果不太理想，給臨床醫(yī)生帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)[3]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體是一種主要分布在細(xì)胞膜蛋白上的受體型蛋白酪氨酸激酶，其中FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4是目前已知的四種類型。FGFR作為一種重要的抗腫瘤藥物靶標(biāo)，尤其是FGFR4，已經(jīng)被大量研究證實(shí)在乳腺癌、胃癌、胰腺癌的診治中能夠發(fā)揮重要的作用，但是在肝癌中應(yīng)用的研究較少[4]。本次研究通過(guò)對(duì)FGFR4基因沉默對(duì)HCC細(xì)胞生物學(xué)行為影響機(jī)制進(jìn)行深入研究，來(lái)為HCC的診療提供更多的參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料 本次實(shí)驗(yàn)所使用的人肝癌細(xì)胞株smmc-7721采購(gòu)于上?；鄯f生物科技有限公司，在本院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳代培養(yǎng)的操作。

1.2 研究方法 本次研究一共設(shè)計(jì)三條慢病毒載體(siRNA)并選擇出最高效的一種來(lái)進(jìn)行FGFR4的基因沉默，并通過(guò)對(duì)慢病毒載體質(zhì)粒重組構(gòu)建陰性對(duì)照質(zhì)粒，之后進(jìn)行慢病毒包裝，根據(jù)滴度實(shí)驗(yàn)公式檢測(cè)病毒滴度是否符合實(shí)驗(yàn)要求，并選擇出最有效率的慢病毒滴度進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。本研究設(shè)立三組，其中A組為未進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的正常細(xì)胞組，B組為FGFR4基因序列被打亂后重組的陰性對(duì)照組，C組為經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的FGFR4基因沉默組。

1.3 觀察指標(biāo) 將A、B和C三組細(xì)胞處理后鋪至96孔板上，在鋪到板上的第一天至第四天，向板上的每個(gè)孔中都加入CCK-8試劑，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)三組細(xì)胞的吸光度來(lái)判斷三組細(xì)胞的增殖能力。構(gòu)建Transwell小室，然后將三組細(xì)胞懸液放置在其上層培養(yǎng)24小時(shí)，倒置顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)每組細(xì)胞穿出上層小室的數(shù)量，使用200×光鏡，每組觀察十個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)量，對(duì)比三組的平均統(tǒng)計(jì)結(jié)果，判斷三組細(xì)胞的侵襲能力。采用流式細(xì)胞儀，并根據(jù)Annexin V-APC/PI雙染法來(lái)觀察和對(duì)比三組細(xì)胞的凋亡情況。采用Western Blot法檢測(cè)三組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：pSTAT3、pERK和ERK信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況；增殖標(biāo)志物PCNA、上皮標(biāo)志物E-Cadeherin和間葉細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)情況；Bcl-xL、Caspase-3和FLIP等相關(guān)凋亡分子的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料間均數(shù)的差異比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞增殖情況 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR4基因沉默后(C組)，在第二天到第四天的時(shí)間，細(xì)胞增殖明顯低于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組和B組對(duì)比，各個(gè)時(shí)間均無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 3組細(xì)胞增殖情況比較圖

2.2 3組細(xì)胞侵襲能力比較 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，A組和B組的細(xì)胞穿出計(jì)數(shù)(59.8±3.17，61.5±4.26)均顯著高于C組(36.8±5.13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組和B組兩組間對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 3組細(xì)胞凋亡情況 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR4基因沉默(siRNA)后的C組細(xì)胞凋亡分布的區(qū)域顯著高于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 3組細(xì)胞凋亡分布圖

2.4 3組細(xì)胞FGFR4蛋白和相關(guān)效應(yīng)蛋白表達(dá)情況 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR4的蛋白表達(dá)對(duì)比，A組和B組顯著高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他效應(yīng)蛋白的對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，C組FLIP、PCNA、Bcl-xL、pERK、pSTAT3和Vimentin的表達(dá)均顯著低于A組和B組，而Caspase-3和E-cadeherin的表達(dá)則顯著高于另外兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3。

3 討論

HCC作為一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤疾病，其治療方法一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，手術(shù)切除和放化療是目前的主要治療方法，但其療效并不理想，尤其是對(duì)于患者生存率的提高并不顯著[5，6]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療藥物被越來(lái)越多的用于臨床治療腫瘤疾病的研究，如VEGF和EGFR等，其在乳腺癌、肺癌等腫瘤疾病的臨床治療中已經(jīng)取得了非常明顯的進(jìn)展，但是這些并沒(méi)有給肝癌的臨床治療帶來(lái)幫助[7，8]。找到一種有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于HCC的治療意義重大。近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越多的開(kāi)始關(guān)注FGFR家族，尤其是FGFR4，作為一種重要的抗腫瘤藥物靶標(biāo)被國(guó)內(nèi)外的研究者和藥物專家所廣泛關(guān)注[9]。

國(guó)外的一些研究將FGFR4沉默應(yīng)用到乳腺癌以及結(jié)腸癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞都因FGFR4的沉默，而出現(xiàn)了顯著的侵襲能力減弱，增殖能力受到抑制，而且細(xì)胞存活率也明顯下降[10]。本次研究通過(guò)對(duì)比不同處理因素下三組間的細(xì)胞吸光度差異后發(fā)現(xiàn)，C組吸光度顯著低于另外兩組，而另外兩組間對(duì)比無(wú)明顯差異，細(xì)胞吸光度的高低可以反映細(xì)胞的生存率，即細(xì)胞的增殖能力，而本次研究結(jié)果證實(shí)，肝癌細(xì)胞受到FGFR4被沉默的影響，增值能力明顯得到了抑制。對(duì)細(xì)胞穿越計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，受到FGFR4被沉默的影響，C組肝癌細(xì)胞穿越數(shù)量顯著降低，這說(shuō)明C組癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。對(duì)三組細(xì)胞凋亡情況的分析，發(fā)現(xiàn)C組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于另外兩組，細(xì)胞凋亡率明顯升高。這些研究結(jié)果均與國(guó)內(nèi)外將FGFR4沉默應(yīng)用于其他惡性腫瘤疾病的研究結(jié)果一致[11]。我們通過(guò)進(jìn)一步對(duì)三組間相關(guān)效應(yīng)蛋白表達(dá)情況的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL和FLIP作為重要的凋亡通路和相關(guān)凋亡分子，增殖標(biāo)志物PCNA都在C組出現(xiàn)了明顯的降低，而Caspase-3的表達(dá)顯著升高，這進(jìn)一步證實(shí)HCC細(xì)胞的增殖能力被明顯抑制。pERK和pSTAT3兩種蛋白表達(dá)受到FGFR4沉默的影響明顯降低，這表明FGFR4沉默后，對(duì)這兩種信號(hào)通路產(chǎn)生了顯著的影響，進(jìn)而對(duì)HCC細(xì)胞的生物學(xué)特性產(chǎn)生了重要影響。而C組間充質(zhì)標(biāo)記Vimentin蛋白表達(dá)的明顯降低和上皮標(biāo)記E-Cadeher表達(dá)的增高，說(shuō)明FGFR4沉默后對(duì)上皮-間葉轉(zhuǎn)化的通路表達(dá)產(chǎn)生了抑制作用，這與國(guó)外關(guān)于結(jié)腸癌的此類研究結(jié)果相一致[12]。

綜上所述，F(xiàn)GFR4沉默后，肝癌細(xì)胞的增殖能力受到了顯著的抑制，癌細(xì)胞侵襲性明顯下降，肝癌細(xì)胞的凋亡率顯著上升。這一特性在肝癌的臨床治療中，能夠發(fā)揮巨大的作用，值得進(jìn)行深入研究。