黃麗萍+林霞

[摘要] 目的 觀察不同宮頸病變患者組織中p16蛋白的表達(dá)，探討p16蛋白作為CINⅡ分流參考指標(biāo)的可行性。 方法 選取2013年1月～2015年8月于南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院行陰道鏡下活檢病理證實(shí)為子宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌四組標(biāo)本各170例，進(jìn)行p16免疫組化染色，觀察各組不同宮頸病變中p16表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)p16蛋白檢測(cè)在診斷宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變2級(jí)及以上（簡(jiǎn)稱CINⅡ+，包括CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌）中的效能。并對(duì)確診的170例CINⅡ患者進(jìn)行每6個(gè)月1次的隨訪直至確診后2年，隨訪異常患者則行陰道鏡下活檢，分析p16蛋白表達(dá)情況與患者CINⅡ級(jí)病變轉(zhuǎn)歸結(jié)局的關(guān)系。 結(jié)果 ①宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ及宮頸癌組p16蛋白陽性率分別為3.53%、41.18%、81.18%、100%，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；CINⅡ組p16蛋白陽性率顯著高于宮頸炎組、CINⅠ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），CINⅢ與宮頸癌組p16蛋白陽性率顯著高于CINⅡ、CINⅠ、宮頸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。②p16蛋白檢測(cè)CINⅡ+的靈敏度、特異度、符合率、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別是90.59%、77.65%、84.12%、80.21%、89.19%。③138例p16蛋白表達(dá)陽性的CINⅡ隨訪異常患者中62例（44.93%）病變進(jìn)展，32例p16蛋白表達(dá)陰性的CINⅡ隨訪異?；颊咧?例（9.38%）病變進(jìn)展，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 隨著宮頸病變程度的加重，p16蛋白陽性率不斷增加。p16蛋白檢測(cè)在發(fā)現(xiàn)CINⅡ+的病變中具有較好的靈敏度、特異度、符合率、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。p16蛋白表達(dá)情況可預(yù)測(cè)CINⅡ疾病進(jìn)展情況，臨床上可應(yīng)用于CINⅡ的分流。

[關(guān)鍵詞] 宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p16蛋白；子宮頸癌；高度鱗狀上皮內(nèi)??；低度上皮內(nèi)病變

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（b）-0083-05

[Abstract] Objective To observe the expression of p16 protein in the tissues of patients with different cervical lesions， and to investigate the feasibility of p16 protein as a reference index of CIN Ⅱ. Methods From January 2013 to August 2015， 170 cases underwent colposcopy and biopsy in Zhongshan BOAI Hospital Affiliated to Southern Medical University proved cervicitis， CIN Ⅰ and CIN Ⅱ， CIN Ⅲ and four cervical carcinoma group were selected， the expression of p16 were observed in different cervical lesions by p16 immunohistochemical staining， efficiency of the test of p16 protein in the diagnosis of CIN Ⅱ and above statistic （CINⅡ+， including CIN Ⅱ， CIN Ⅲ and cervical cancer） performance. And 170 cases of CIN Ⅱ patients were followed up every six months until 2 years after diagnosis with abnormal colposcopic biopsy， the relationship between the expression of p16 and outcome measures of CIN Ⅱ patients lesions was analyzed. Results ①The p16 positive rates of the cervicitis group and CIN Ⅰ group and CIN Ⅱ group， CIN Ⅲ and cervical cancer groups were 3.53%， 41.18%， 81.18%， 100% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the positive rate of p16 protein in the CINⅡ group was significantly higher than that of cervicitis group and CIN Ⅰ group， the differences were statistically significant （P < 0.01）， the positive rate of p16 protein in the CIN Ⅲ group and cervical cancer group were significantly higher than CINⅡ group， CINⅠgroup， cervicitis group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. ②The sensitivity， specificity， coincidence rate， positive predictive value and negative predictive value of p16 protein in the detection of CINⅡ+ were respectively 90.59%， 77.65%， 84.12%， 80.21% respectively， 89.19%. ③62 cases （44.93%） in 138 CIN Ⅱ patients with positive expression of p16 protein had abnormal follow-up， 3 cases （9.38%） of 32 cases of disease progression CIN Ⅱ patients with negative expression of p16 protein had abnormal follow-up， the difference of two were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The positive rate of p16 protein increased with the severity of cervical lesions. Detection of p16 protein shows better sensitivity， specificity， coincidence rate， positive predictive value and negative predictive value in the detection of CINⅡ+. The expression of p16 protein can predict the progression of CIN Ⅱ disease， and can be applied to the shunt of CIN Ⅱ in clinic.endprint

[Key words] Cervical intraepithelial neoplasia； Cyclin-dependent kinase inhibitor p16 ；Cervical cancer； High-grade squamous intraepithelial lesion， HSIL； Low-grade squamous intraepithelial lesion

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是宮頸癌發(fā)生前的病變，目前，常用的CIN診斷方法蘇木精-伊紅染色法（HE）法，該法受人為主觀因素影響較大，在CINⅡ診斷中尤為突出。因此，使用生物學(xué)標(biāo)志物為CIN的診斷提供客觀依據(jù)顯得特別重要。

p16蛋白是抑制蛋白，具有抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用[1]。2012年美國病理學(xué)會(huì)（CAP）和美國陰道鏡與宮頸病理學(xué)會(huì)（ASCCP）推薦p16蛋白作為CIN病變?cè)\斷的生物標(biāo)志物，其免疫組化染色可以很好地用于評(píng)估高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變[2]。郭宇雯等[3]研究表明p16可為早期子宮頸癌的病理診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。那么，p16蛋白在不同宮頸病變中的陽性率差異是如何的？p16蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CINⅡ+的效能是如何的？p16蛋白能否為臨床醫(yī)生處理CINⅡ提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)？這一系列疑問非常值得我們進(jìn)一步深入探討。

本研究通過分析在南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）行陰道鏡下活檢病理證實(shí)為子宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌四組標(biāo)本各170例，進(jìn)行p16免疫組化染色，分析各組不同宮頸病變中p16表達(dá)情況及p16發(fā)現(xiàn)CINⅡ+的的效能。并對(duì)確診的170例CINⅡ級(jí)患者進(jìn)行每6個(gè)月1次的隨訪直至確診后2年，隨訪異?；颊邉t行陰道鏡下活檢，分析p16蛋白表達(dá)情況與患者病變轉(zhuǎn)歸結(jié)局的關(guān)系，探討能否應(yīng)用p16作為CINⅡ分流的參考指標(biāo)，從而為臨床處理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2015年8月于我院行陰道鏡下活檢680例宮頸組織標(biāo)本，患者年齡22～79歲，平均年齡（49.6±9.8）歲；其中宮頸炎性患者、CINⅠ級(jí)患者、CINⅡ級(jí)患者、CINⅢ及宮頸癌患者各170例；納入宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌病變患者。患者未接受相關(guān)手術(shù)、藥物、物理治療；無合并其他惡性疾?。粺o自身免疫疾??；未服用免疫抑制藥物；非妊娠期、非月經(jīng)期。

1.2 試劑與設(shè)備

3ML LED光學(xué)電子陰道鏡為德國萊斯康公司生產(chǎn)，SAKURA Tissue Tek Vip-5全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)、DRS-2000J-D2全自動(dòng)染色機(jī)均為日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社生產(chǎn)。Thermo HM325輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)為德國Thermo生產(chǎn)，切片厚度2～3 μm。Bench Mark XT自動(dòng)免疫組化染色機(jī)由美國Ventana公司生產(chǎn)。DM3000生物顯微鏡由德國徠卡公司生產(chǎn)?？筽16（E6H4，規(guī)格：50測(cè)試/盒）鼠單克隆抗體試劑及免疫組化檢測(cè)試劑盒購自美國Ventana Medical Systems公司。

1.3 組織標(biāo)本采集、制片及HE染色

陰道鏡下取宮頸活體組織標(biāo)本，經(jīng)4%中性緩沖甲醛固定，二甲苯透明，酒精脫水、浸蠟等程序按中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)會(huì)病理技術(shù)相關(guān)規(guī)程進(jìn)行[4]，包埋，2～3 μm厚切片，裱片于防脫片載玻片上。HE染色程序如下：切片分別經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精脫水，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，HE染色，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 p16蛋白檢測(cè)

烘干的切片在Bench Mark XT自動(dòng)免疫組化染色機(jī)進(jìn)行染色，中性樹膠封固。每次染色均以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的宮頸癌p16蛋白陽性標(biāo)本作陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照廠家的試劑、儀器說明書執(zhí)行操作。p16蛋白判讀參考探針試劑盒說明和相關(guān)文獻(xiàn)[2]。染色結(jié)果分為3種模式：鱗狀上皮的基底和基底旁細(xì)胞層出現(xiàn)連續(xù)性棕黃色著色，呈彌漫陽性（>25%）判定為陽性，點(diǎn)狀、灶狀著色呈局灶陽性（≤25%）或無著色判定為陰性[5-6]。本研究中將組織病理學(xué)結(jié)果為CINⅡ+定為陽性。

1.5 隨訪內(nèi)容

對(duì)2013年1月～2015年8月我院確診的170例CINⅡ級(jí)患者進(jìn)行每6個(gè)月1次的隨訪直至確診后2年，隨訪內(nèi)容：包括婦科檢查、TCT檢查、高危型HPV檢查（HC2法）、陰道鏡檢查，如有異常則行陰道鏡下活檢。病變轉(zhuǎn)歸：轉(zhuǎn)歸結(jié)果分為消退、持續(xù)和病變進(jìn)展3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，以未發(fā)現(xiàn)CIN病變?yōu)橄?，以持續(xù)CINⅡ病變?yōu)槌掷m(xù)，以發(fā)現(xiàn)病變CINⅢ及其以上為進(jìn)展。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，比較四組宮頸疾病的p16蛋白陽性率的總體差異檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α=0.05，四組不同子宮頸病變的兩組組間進(jìn)行比較時(shí)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α′=0.008（0.05/6）。

2 結(jié)果

2.1 不同子宮頸病變組織HE染色及對(duì)應(yīng)的p16蛋白染色陽性圖像

宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ及宮頸癌組患者HE染色圖像及對(duì)應(yīng)的p16蛋白染色陽性圖像見圖1（封三）。HE染色顯示：慢性子宮頸炎組織上皮細(xì)胞呈慢性炎改變；子宮頸CINⅠ組織上皮異型細(xì)胞局限于上皮層的下1/3區(qū)；子宮頸CINⅡ組織上皮異型細(xì)胞占上皮層的1/3～2/3；子宮頸CINⅢ組織上皮異型細(xì)胞超過上皮層的2/3但還未累及上皮全層；子宮頸癌組織上皮異型細(xì)胞累及上皮全層。p16蛋白染色：p16蛋白陽性部分從上皮層的頂部逐漸累及上皮全層。

2.2 四組不同子宮頸病變患者p16蛋白陽性率的比較endprint

宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ及宮頸癌組患者p16蛋白陽性率見表1，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=191.633，P < 0.05）；CINⅡ組p16蛋白陽性率顯著高于宮頸炎組、CINⅠ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01），CINⅢ與宮頸癌組p16蛋白陽性率顯著高于CINⅡ、CINⅠ、宮頸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。提示p16蛋白隨著宮頸病變程度的加重，陽性率不斷增加。

2.3 p16蛋白檢出CINⅡ+病變情況

將組織病理診斷結(jié)果為CINⅡ+定為金標(biāo)準(zhǔn)的陽性患者，p16蛋白檢測(cè)結(jié)果為陽性與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，p16蛋白發(fā)現(xiàn)CINⅡ+病變的靈敏度、特異度、符合率、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別是90.59%（308/340）、77.65%（267/340）、84.12%（572/680）、80.21%（308/384）、89.19%（264/296）。提示p16蛋白檢測(cè)具有良好的發(fā)現(xiàn)CINⅡ+的效能。見表2。

2.4 不同p16蛋白表達(dá)情況的CINⅡ患者病變進(jìn)展

138例p16蛋白表達(dá)陽性的CINⅡ級(jí)隨訪異常患者中62例（44.93%）病變進(jìn)展，32例p16蛋白表達(dá)陰性的CINⅡ級(jí)隨訪異?；颊咧?例（9.38%）病變進(jìn)展，p16蛋白表達(dá)陽性的CINⅡ級(jí)患者病變進(jìn)展率是p16蛋白表達(dá)陰性的4.79倍，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

宮頸上皮內(nèi)瘤變是宮頸癌發(fā)展過程中的癌前期病變，及時(shí)發(fā)現(xiàn)癌前病變并給予合適的治療是預(yù)防宮頸癌發(fā)生、降低宮頸癌死亡率的重要手段。2012年ASCCP關(guān)于下生殖道鱗狀上皮病變項(xiàng)目（LAST project）建議，用“病變（lesion）”取代了“腫瘤（neoplasia）”[7]，2014年出版的《WHO女性生殖器官腫瘤學(xué)分類（第4版）》將宮頸病變分為低度鱗狀上皮內(nèi)病變及高度鱗狀上皮內(nèi)病變[8]。

目前，在大部分文獻(xiàn)中仍沿用CIN的說法。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）宮頸癌篩查指南，CINⅠ患者主要臨床處理為隨訪觀察，CINⅡ/Ⅲ治療主要為子宮頸錐切術(shù)。但研究[9]顯示，CINⅡ的生物學(xué)行為更接近CINⅠ，最終發(fā)展成宮頸浸潤(rùn)癌的只有不到5%。因此，如果對(duì)所有的CINⅡ患者進(jìn)行手術(shù)治療則會(huì)導(dǎo)致一定程度的過度治療。因此臨床迫切需要簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)手段以協(xié)助醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行分流，以減少過度治療或延誤診治的發(fā)生。p16基因位于人類染色體9P21，該蛋白通過抑制CDK4的活性，從而阻止Rb蛋白的磷酸化，最終使細(xì)胞停滯于G0期或G1期，而抑制細(xì)胞分裂、增殖[10]。

本研究結(jié)果可見，宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ及宮頸癌組患者p16陽性率，總體差異有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=191.633，P < 0.05）；CINⅡ組p16蛋白陽性率顯著高于宮頸炎組、CINⅠ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），CINⅢ及宮頸癌組陽性率為100%，提示p16蛋白隨著宮頸病變程度的加重，陽性率不斷增加。

本次研究中，筆者將組織病理診斷結(jié)果CINⅡ+定為金標(biāo)準(zhǔn)的陽性患者，p16蛋白檢測(cè)結(jié)果為陽性的患者與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。p16蛋白發(fā)現(xiàn)CINⅡ以上病變的特異度、靈敏度、符合率、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別是90.59%、77.65%、84.12%、80.21%、89.19%，提示p16蛋白檢測(cè)具有良好的發(fā)現(xiàn)CINⅡ+的效能。

在證實(shí)了上述兩觀點(diǎn)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)確診的170例CINⅡ級(jí)患者進(jìn)行每6個(gè)月1次的隨訪直至確診后2年，隨訪異常患者則行陰道鏡下活檢，分析了p16蛋白表達(dá)情況與患者CINⅡ級(jí)病變轉(zhuǎn)歸結(jié)局的關(guān)系，從本研究檢測(cè)的p16蛋白表達(dá)與CINⅡ疾病進(jìn)展情況來分析，p16蛋白表達(dá)陽性的CINⅡ級(jí)患者病變進(jìn)展率是p16蛋白表達(dá)陰性的4.79倍。因此，本研究認(rèn)為p16蛋白檢測(cè)可在臨床上可應(yīng)用于CINⅡ的分流。有研究證實(shí)p16蛋白檢測(cè)在CINⅠ具有很好的分流作用[11-16]，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)p16/Ki67雙染檢測(cè)在意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞具有分流診斷中的作用[17-23]。而本研究應(yīng)用p16蛋白檢測(cè)針對(duì)臨床迫切需要而病理容易誤診的CINⅡ級(jí)大樣本病例進(jìn)行探討，旨在尋求一種簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)手段有助于預(yù)測(cè)CINⅡ患者的預(yù)后檢測(cè)指標(biāo)，可以真正意義上對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療，也能更好地管理隨訪這部分患者，從而降低宮頸癌的發(fā)生率。因此，p16檢測(cè)具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2017-10-23 本文編輯：任 念）endprint