李杉杉,劉悅，唐詩慧，方步武

（天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，天津300070）

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肝纖維化發(fā)病的關(guān)鍵細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成與其降解平衡遭到外界因素破壞，導(dǎo)致肝臟內(nèi)部ECM合成過多同時降解太少而形成肝纖維化[1]。常年過量攝入酒精可導(dǎo)致機體獲得酒精肝病，臨床常見特征為肝臟脂肪性病變同時炎癥損傷，嚴(yán)重時可產(chǎn)生肝纖維化，最終演變?yōu)殡y以逆轉(zhuǎn)的肝硬化，甚至于無法挽救的肝癌[2]。本實驗小組研究的復(fù)方藥物主要由中藥白花蛇舌草、鱉甲、地瑜、虎杖、青蒿等構(gòu)成。該方劑的組方原則為活血化疲、清熱利濕、軟堅散結(jié),其組成藥物對治療慢性肝炎、肝纖維化有較好的療效[3]。本課題組前期工作證明，先水后醇60%提取方案的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對大鼠肝星狀細(xì)胞具有抑制作用。本實驗在制備的酒精性大鼠肝纖維化模型上，進一步研究其他不同提取方案的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方抗肝纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量120～150 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。合格證號：SCXK-(軍)2016-014。實驗前，大鼠在動物房適應(yīng)環(huán)境7日，自由進食正常大鼠飼料及飲水。動物房溫度20～22℃，24 h恒溫。

1.1.2 試劑及儀器 復(fù)方鱉甲軟肝片：規(guī)格250 mg，天津市南開醫(yī)院提供，批號：Z19991011。BCA蛋白濃度測定試劑盒：江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號：P0010。Nrf2抗體：武漢博士德生物工程有限公司，批號：PB0327。γ-GCS抗體：武漢博士德生物工程有限公司，批號：PB0197。β-actin抗體：碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號：AA128。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔lgG(H＋L)：碧云天生物技術(shù)研究所，批號：K9908。兔超敏二步法檢測試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，編號:PV-9001。垂直電泳槽（Bio-rad公司），高速冷凍離心機（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)方提取 先水后醇60%復(fù)方提取方案：每份藥材稱取141.6 g，先將鱉甲加入6倍量總藥材體積的水浸泡2 h，加入剩下的其余藥材共同文火煎煮1次，1次1 h，過濾并收集水提液。再向剩余藥渣中加入6倍量總藥材體積的60%乙醇共同文火煎煮兩次，每次30 min，過濾并收集醇提液，次日用旋蒸儀進行水提液、醇提液的濃縮備用。復(fù)方先水后醇95%提取方案：每份藥材稱取141.6 g，先將鱉甲加入6倍量總藥材體積的水浸泡2 h，加入剩下的其余藥材共同文火煎煮1次，1次1 h，過濾并收集水提液。再向剩余藥渣中加入6倍量總藥材體積的95%乙醇共同文火煎煮兩次，每次30 min，過濾并收集醇提液，次日用旋蒸儀進行水提液、醇提液的濃縮備用。復(fù)方水提醇沉提取方案：每份藥材稱取141.6 g，先將鱉甲加入8倍量總藥材體積的水浸泡2 h，加入剩下的其余藥材共同文火煎煮1次，1次2 h，過濾并收集水提液。待水提液冷卻后，邊攪拌邊加入一定量的95%乙醇，靜置于4℃冰箱并過夜。次日緩慢取上清液并用真空泵抽濾，收集所得液體，濃縮備用。

1.2.2 模型制備 造模大鼠8:00灌胃白酒，每日1次，酒精濃度逐漸增加，依次為10%、20%、30%、40%、50%、60%，每個濃度灌胃2 d，最后增至65%并維持該濃度再灌胃8周，體積均為1.2 mL。100g-1·d-1（相當(dāng)于 6.2 g·kg-1·d-1），并用吡唑 25 mg·kg-1·d-1溶于酒內(nèi)灌胃。期間，正常組大鼠正常進食動物標(biāo)準(zhǔn)飼料并每天灌胃同一組蒸餾水。

1.2.3 分組給藥 對全部80只大鼠按質(zhì)量隨機區(qū)組法分為正常組，模型組，先水后醇60%組，先水后醇95%高、低劑量組，水提醇沉高、低劑量組，復(fù)方鱉甲軟肝片組。同時對6個治療組進行預(yù)防性用藥，每天1次于傍晚灌胃不同提取方案的復(fù)方治療藥物，以復(fù)方鱉甲軟肝片的臨床等效劑量 [按公式dB=dA*（RB/RA）*（WA/WB）]計算出各組大鼠用藥劑量，由此算得的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方用量作為低劑量（2.59 g·kg-1·d-1）以該劑量的10倍作為高劑量（8.2g·kg-1·d-1）；同時軟肝片組劑量為0.09mg·kg-1·d-1。正常組每天早上8點和下午5點進行灌胃蒸餾水，模型組則每天下午5點灌胃蒸餾水。每日1次，維持10周。

1.2.4 動物處理 10周實驗結(jié)束后處理動物。記錄大鼠質(zhì)量，腹腔注射烏拉坦（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%）（0.5 mL/100 g），大鼠取臥位切開腹部，腹腔靜脈取血制備血清，-20℃保管。及時分離存取3部分肝組織，先用10%中性緩沖甲醛液固定，再以脫水劑（氯仿∶甲醇=2∶1，V/V）脫脂脫水，放入-80 ℃保存。

1.2.5 肝組織中羥脯氨酸含量測定 采用酸水解法測定羥脯氨酸含量。將肝組織用研缽研磨成粉，60℃烘干粉末至恒重，稱取30 mg放入定做的透明的15 mL安瓿瓶中，加入8 mL 6 mol/L的HCl，用酒精噴燈封口，置烘箱內(nèi)105℃恒溫水解18 h，冷卻后過濾,取50 μL濾液于試管內(nèi)，60℃烘干。依次加入50%異丙醇、0.56%氯胺T溶液和ER液，充分混勻，50℃水浴90 min。蒸餾水調(diào)零，試劑空白校正，測定波長558 nm處OD值。對肝纖維化程度進行定量分析。

1．2．6 肝組織Nrf2蛋白與γ-GCS蛋白表達水平分析 采用Western blotting法。稱取約50 mg的肝組織，加入約200 μL RIPA裂解液。冰浴條件下勻漿，使其充分裂解。4℃10 000×g離心5 min，取上清液，-20℃保存。BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進行蛋白定量。上樣相當(dāng)于50 μg的總蛋白，15%的SDSPAGE電泳分離，使其轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，一抗(1∶500)于4℃孵育過夜，第2天置于二抗中（1∶1 000）室溫孵育2 h。使用ECL試劑盒進行顯色反應(yīng)。β-actin作為正常蛋白水平的對照。膠片掃描后采用Image J軟件進行圖像分析。

1．2．7 肝組織Nrf2蛋白與γ-GCS蛋白的病理表達 采用免疫組化法測定。分別用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇梯度脫蠟至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6．8）中高壓，10%正常羊血清孵育,滴加一抗，4℃冰箱中過夜,PBS緩沖液振蕩清洗后分別滴加二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)封片。采用Image-Pro Plus軟件分析免疫組化圖片陽性面積（Area）以及其累計光密度（IOD）值,結(jié)果以平均光密度（meandensity=IOD/Area）表示。

2 結(jié)果

2．1 不同提取方案的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對實驗大鼠一般情況的影響 正常組大鼠生長良好，飲食規(guī)律；模型組大鼠日漸消瘦，行為遲緩，進食減少；各治療組大鼠體瘦，但活動尚好，先水后醇95%提取組和復(fù)方鱉甲軟肝片組之間無明顯差異。

2．2 肝組織中膠原蛋白含量結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠肝組織膠原蛋白含量增高（P＜0．01）；與模型組比較，各治療組大鼠肝組織膠原含量均降低(P＜0．05)，且先水后醇 60%組，先水后醇 95%高、低劑量組以及復(fù)方鱉甲軟肝片組膠原蛋白含量顯著降低（P＜0．01）。與水提醇沉高劑量組比較，先水后醇60%高劑量組、先水后醇95%高劑量組膠原蛋白含量顯著降低（P＜0．01）（表 1）。

2．3 肝組織Nrf2蛋白與γ-GCS蛋白的Western blotting結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠肝組織Nrf2蛋白與 γ-GCS蛋白表達增高（P＜0．01）；與模型組比較，各治療組大鼠肝組織Nrf2蛋白與γ-GCS蛋白表達增高（P＜0．01）；與先水后醇60%組比較，先水后醇95%高劑量組肝組織Nrf2蛋白與γ-GCS蛋白表達增高（P＜0．01）（表 2、圖 2）。

表1 酒精性肝纖維化大鼠肝組織中膠原蛋白含量變化 （±s）Tab 1 Changes of collagen content in the liver tissue of alcoholic liver fibrosis rats （±s）

表1 酒精性肝纖維化大鼠肝組織中膠原蛋白含量變化 （±s）Tab 1 Changes of collagen content in the liver tissue of alcoholic liver fibrosis rats （±s）

與正常組比較 **P＜0．01；與模型組比較 #P＜0．05,##P＜0．01；與水提醇沉高劑量組比較▲▲P＜0．01

組別 n 膠原蛋白/mg·g-1正常組 8 2．06±0．36模型組 9 5．26±0．38**先水后醇 60%組 7 2．78±0．29##▲▲先水后醇 95%高劑量組 8 2．82±0．21##▲▲先水后醇 95%低劑量組 8 3．56±0．42##水提醇沉高劑量組 8 4．18±0．81#水提醇沉低劑量組 8 4．24±0．46#復(fù)方鱉甲軟肝片組 8 2．41±0．53##▲▲

表2 不同提取方案復(fù)方對酒精性肝纖維化大鼠肝組織中Nrf2和γ-GCS 蛋白表達的影響 （±s，n=8）Tab 2 Effects of different extraction schemes of HBYYRJP on the expressions of Nrf2 and γ-GCS （±s，n=8）

表2 不同提取方案復(fù)方對酒精性肝纖維化大鼠肝組織中Nrf2和γ-GCS 蛋白表達的影響 （±s，n=8）Tab 2 Effects of different extraction schemes of HBYYRJP on the expressions of Nrf2 and γ-GCS （±s，n=8）

與正常組比較，*P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．01；與先水后醇 60%提取方案組比較，△P＜0．01

組別 Nrf2/β-Actin γ-GCS/β-Actin正常組 0．130±0．036 0．091±0．027模型組 0．404±0．021* 0．509±0．031*先水后醇 60%組 0．900±0．008*# 0．733±0．018*#先水后醇 95%高劑量組 0．868±0．014*#△ 0．661±0．012*#△先水后醇 95%低劑量組 0．791±0．027*# 0．707±0．026*#水提醇沉高劑量組 0．418±0．042* 0．519±0．040*水提醇沉低劑量組 0．400±0．032* 0．495±0．036*復(fù)方鱉甲軟肝片組 1．088±0．028*#△ 0．959±0．022*#△

圖2 不同提取方案的復(fù)方對肝組織中Nrf2蛋白與γ-GCS蛋白表達的影響Fig 2 Effects of different extraction schemes of HBYYRJP on the expressions of Nrf2 and γ-GCS in liver tissue

2．4 肝組織Nrf2與γ-GCS蛋白的免疫組化染色結(jié)果 與正常組比較，模型組可顯著上調(diào)肝細(xì)胞胞漿中的 Nrf2和 γ-GCS蛋白的表達（P＜0．01）；與模型組比較，先水后醇95%高、低劑量組的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中Nrf2和γ-GCS蛋白的棕色顆粒明顯增多（P＜0．01）；與低劑量組比較，高劑量組出現(xiàn)明顯的核轉(zhuǎn)位（P＜0．01）（表 3、圖 3、4）。

表3 先水后醇95%提取方案對大鼠肝組織Nrf2和γ-GCS蛋白表達的影響 （±s，n=8）Tab 3 Effects of water followed by 95%ethyl alcohol extraction scheme on the expressions of Nrf2 and γ-GCS in the liver tissue of alcoholic liver fibrosis rats （±s，n=8）

表3 先水后醇95%提取方案對大鼠肝組織Nrf2和γ-GCS蛋白表達的影響 （±s，n=8）Tab 3 Effects of water followed by 95%ethyl alcohol extraction scheme on the expressions of Nrf2 and γ-GCS in the liver tissue of alcoholic liver fibrosis rats （±s，n=8）

與正常組比較 **P＜0．01；與模型組比較 ##P＜0．01；與低劑量組比較▲P＜0．01

組別 Nrf2（平均光密度） γ-GCS（平均光密度）正常組 0．093±0．032 0．046±0．022模型組 0．096±0．021** 0．082±0．015**先水后醇 95%高劑量組 0．268±0．032##▲ 0．252±0．024##▲先水后醇 95%低劑量組 0．191±0．012## 0．187±0．036##復(fù)方鱉甲軟肝片組 0．303±0．017##▲ 0．299±0．021##▲

圖3 先水后醇95%提取方案對大鼠肝組織Nrf2蛋白表達的影響（×400）Fig 3 Effectsofwaterfollowedby95%ethylalcoholextractionscheme on the expressions of Nrf2 in the liver tissue of alcoholic liver fibrosis rats(×400)

圖4 先水后醇95%提取方案對大鼠肝組織γ-GCS蛋白表達的影響(×400)Fig 4 Effectsofwaterfollowedby95%ethylalcoholextractionscheme on the expresstion of γ-GCS in the liver tissue of alcoholic liver fibrosis rats(×400)

3 討論

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）包含著較廣范圍的肝病，即包括脂肪肝（脂肪性肝炎)以及更嚴(yán)重的肝損傷類型，如酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化以及肝細(xì)胞癌（HCC）[4]。ALD擁有著龐大且繁雜的發(fā)病機制，乙醇進入肝臟代謝生成乙酸過程中產(chǎn)生的活性氧簇（ROS）發(fā)揮了重要作用[5]。

ROS通過激發(fā)相關(guān)通路參與機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，進一步加劇機體肝纖維化進程，Nrf2/ARE通路就是現(xiàn)在肝纖維化相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，ROS通過產(chǎn)生一定的細(xì)胞內(nèi)刺激，導(dǎo)致Keap1蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，會與Nrf2解離并促進其移位入核[6]，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子-2(Nrf2)可以調(diào)控一系列具有抗氧化和解毒作用基因的轉(zhuǎn)錄因子。通過結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(ARE)啟動子序列，激活與GSH合成與再生表達相關(guān)的酶，包括γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶的催化和調(diào)控亞單位(即γ-GCS以及GCLm)[7]。Nrf2與γ-GCS抗氧化因子之間的協(xié)同作用，有利于機體對抗自由基避免肝細(xì)胞損傷，同時增強γ-GCS、GSH等相關(guān)酶活性在氧化防御中的關(guān)鍵作用，進而減慢肝纖維化進程[8]。

中藥丹參、鱉甲、白花蛇舌草、虎杖以及青蒿等成分是蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方的主要組成藥物。韓仕慶[9]發(fā)現(xiàn)丹參含藥血清可以抑制HSCs的活化，可能是通過誘導(dǎo)HSCs中Smo蛋白和α-SMA mRNA的活化表達發(fā)揮其作用。前期體內(nèi)實驗已表明先水后醇60%提取方案的復(fù)方通過抗脂質(zhì)過氧化損傷從而減輕酒精性肝損傷。

本研究旨在進一步探討其他提取方案的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方抗肝纖維化的作用機制。實驗采用的酒精性大鼠模型是經(jīng)過改良且最為接近人類長期酗酒肝纖維化病理過程[10]。實驗結(jié)果表明，正常組、先水后醇60%提取方案組以及先水后醇95%提取方案大鼠肝組織內(nèi)膠原蛋白含量顯著低于模型組，而水提醇沉提取方案效果不佳。說明先水后醇提取方案的復(fù)方可以減少肝臟中沉積的膠原纖維進而防止ECM沉積，且醇提濃度較低時更明顯，提示復(fù)方中的醇溶性成分較水溶性成分抗肝纖維化作用更明顯。此外，先水后醇95%提取方案組大鼠肝組織中Nrf2和γ-GCS蛋白表達量較正常組和模型組顯著提高，說明此提取方案得到的復(fù)方通過上調(diào)Nrf2和γ-GCS蛋白表達發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而減輕甚至逆轉(zhuǎn)酒精性肝纖維化。此外，高劑量組Nrf2和γ-GCS蛋白表達量高于其他治療組，說明此提取方案的復(fù)方上調(diào)Nrf2和γ-GCS蛋白表達抗纖維化作用呈一定劑量依賴性。

綜上所述，先水后醇95%提取方案的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方通過上調(diào)Nrf2/γ-GCS通路，增加Nrf2和γ-GCS蛋白表達，顯著降低肝組織膠原蛋白含量，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。本實驗研究結(jié)果為提取工藝優(yōu)化后的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方在治療酒精性肝纖維化方面提供了一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

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