王劍鋒，方 芳，于 雷，王志成

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院放療科，吉林 長春 130033；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長春 130021；3. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，吉林 長春 130041；4.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點實驗室，吉林 長春 130021)

肝細(xì)胞癌是我國常見的惡性腫瘤，放射治療(放療)是原發(fā)性肝癌的重要治療手段[1]。放療常與手術(shù)、介入栓塞化療、分子靶向藥物和化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，以提高治療效果[2-4]?？垢渭?xì)胞癌藥物消癌平(XAP)注射液的有效成分是中藥材通關(guān)藤提取物，是蘿摩科牛奶菜屬植物通關(guān)散的藤莖，具有清熱解毒、化痰軟堅的作用，臨床上用于食道癌、肺癌和肝癌的治療[5]。XAP可以抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)周期阻滯并促進細(xì)胞凋亡，肝癌細(xì)胞在受射線照射后可出現(xiàn)G2期阻滯，但兩者聯(lián)合應(yīng)用對肝細(xì)胞癌作用機制方面的研究少有報道。本研究旨在將XAP與X射線聯(lián)合應(yīng)用，探討其協(xié)同增強對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，為肝細(xì)胞癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑人肝癌HepG2細(xì)胞由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點實驗室保存。培養(yǎng)血清及高糖DMEM培養(yǎng)基(江蘇恩莫阿塞生物技術(shù)有限公司)，AnnexinⅤ/FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，碘化丙啶(propidium iodide,PI，美國Sigma公司)，CCK8試劑盒(Cell Counting Kit-8，日本Dojindo公司)，GAPDH和caspase-3多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，XAP注射液(南京圣合藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z20025868，每支20 mL，含有效成分通關(guān)藤25 g)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗分組及細(xì)胞處理實驗分為對照組、XAP組、2 Gy照射組和XAP + 2 Gy照射組。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及青、鏈霉素的高糖DMEM中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，XAP注射液在終濃度>50 mg·L-1的情況下具有明顯的效應(yīng)，所以本實驗采用的終濃度為75 mg·L-1。按照實驗分組分別將生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞按照一定的濃度接種于96孔、24孔和6孔板，分別檢測細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期進程和細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)。X射線照射采用X-RAD320生物輻照儀(美國PXI公司)，照射條件：電壓180 kV，電流12.0 mA，靶皮距70 cm，劑量率 1.0 Gy·min-1，總劑量為2 Gy。

1.3 CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性HepG2細(xì)胞按照5 × 104個細(xì)胞/孔接種于96孔板，24 h后按照終濃度為75 mg·L-1加入XAP注射液預(yù)處理細(xì)胞，12 h后進行2 Gy X射線照射，計為0 h，分別于12、24和48 h后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，輕輕震蕩后在490 nm 處酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度[A(490)]值，代表細(xì)胞增殖活性，實驗設(shè)6復(fù)孔。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期HepG2細(xì)胞按照4 × 105個細(xì)胞/孔接種24孔板，24 h后按照終濃度為75 mg·L-1加入XAP注射液預(yù)處理細(xì)胞，12 h后進行2 Gy X射線照射，24 h后收集細(xì)胞，1 mol·L-1PBS洗2次，每管中加入200 μL的PI和100 μL RNaseA，輕微震蕩混勻，室溫條件避光20 min，上機收細(xì)胞，CellQuest軟件收集，ModFit軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以各期細(xì)胞百分率表示。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率HepG2細(xì)胞接種、加藥和照射處理同1.4，24 h后收集細(xì)胞，1 mol·L-1的PBS洗2次，每個管中加入5 μL PI和5 μL Annexin Ⅴ-FITC試劑，混勻后避光10 min，上機收集細(xì)胞，CellQuest軟件收集，ModFit軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以凋亡細(xì)胞百分率表示。

1.6 Western blotting法檢測caspase-3蛋白表達(dá)HepG2細(xì)胞按照2 × 105個細(xì)胞/孔接種6孔板，24 h后按照終濃度為75 mg·L-1加入XAP注射液預(yù)處理細(xì)胞，12 h后行2 Gy X射線照射，24 h后收集細(xì)胞，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，總蛋白提取后進行定量，按照25 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜后，利用TBST配置的5%脫脂奶粉進行封閉1 h，4℃過夜GAPDH和caspase-3一抗孵育。含有0.05% Tween 20的TBST洗3次，每次5 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃下孵育1 h，TBST洗3次，利用化學(xué)發(fā)光試劑ECL進行顯像，并進行拍照分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖活性HepG2細(xì)胞經(jīng)XAP處理和2 Gy照射后，在12、24和48 h時，與對照組比較，XAP組、2 Gy照射組和XAP + 2 Gy照射組細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且XAP + 2 Gy照射組細(xì)胞增殖活性較XAP組和2 Gy照射組明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組HepG2細(xì)胞的增殖活性

Tab.1 Proliferation activities of HepG2 cells in various groups

表1 各組HepG2細(xì)胞的增殖活性

GroupA(490)value(t/h) 122448Control0．41±0．020．58±0．020．68±0．05XAP0．31±0．02?0．23±0．02??0．28±0．04??2Gyradiation0．28±0．02?0．35±0．01??#0．29±0．02??XAP+2Gyradiation0．15±0．01??△#0．08±0．01??△#0．11±0．01??△#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.01vs2 Gy radiation group;#P<0.01vsXAP group.

2.2 各組細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分率HepG2細(xì)胞經(jīng)XAP處理和2 Gy照射后24 h，與對照組比較，XAP組、2 Gy照射組和XAP+2 Gy照射組S期和G2/M期細(xì)胞百分率明顯增加(P<0.05或P<0.01)，G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.01)，其中2 Gy照射組及XAP + 2 Gy照射組S期和G2/M期細(xì)胞百分率較XAP組均明顯增加(P<0.01)；與XAP組和2 Gy照射組比較，XAP+2 Gy組G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.05 或P<0.01)，G2/M期細(xì)胞百分率增加(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組HepG2細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分率

Tab.2 Percentages of HepG2 cells at different phases in various groups

表2 各組HepG2細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分率

GroupPercentageofcellsG0/G1SG2/MControl55．20±2．1142．89±1．531．90±0．77XAP48．05±1．13??44．34±1．23?7．61±2．35??2Gyradiation26．66±0．95??#58．57±0．69??#14．77±1．61??#XAP+2Gyradiation20．28±1．53??△#60．70±2．12??#18．95±0．84??△#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vs2 Gy radiation group;#P<0.01vsXAP group.

2.3 各組細(xì)胞凋亡率HepG2細(xì)胞經(jīng)XAP處理和2 Gy照射后24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡百分率，對照組、XAP組、2 Gy照射組和XAP+2 Gy照射組細(xì)胞凋亡率分別為(5.78±0.71)%、(14.02±1.05)%、(15.95±0.24)%和(30.53±2.67)%，XAP組、2 Gy組和XAP+2 Gy組細(xì)胞凋亡百分率均較對照組明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與XAP組和2 Gy照射組比較，XAP+2 Gy照射組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。見圖1。

A:Control group; B:XAP group; C:2 Gy radiation group; D:XAP+2 Gy radiation group.

2.4 各組 HepG2細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)HepG2細(xì)胞經(jīng)XAP處理和2 Gy照射后24 h，Western blotting法檢測凋亡蛋白caspase-3的斷裂，可見caspase-3蛋白被切割成相對分子質(zhì)量為17 000和19 000的片段，與對照組比較，XAP組、2 Gy照射組和XAP+2 Gy照射組相對分子質(zhì)量為17 000和19 000的caspase-3片段表達(dá)均增加，提示其細(xì)胞凋亡增加。見圖2。

Lane 1:Control group; Lane 2:XAP group; Lane 3:2 Gy radiation group; Lane 4:XAP+2 Gy radiation group.

3 討 論

美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)肝癌診治指南推薦：外照射放療可作為不能手術(shù)的原發(fā)性肝癌患者的理想治療手段，我國也在原發(fā)性肝癌診療規(guī)范中推薦了肝癌的放射治療。曾昭沖[1]指出：肝癌放療需要結(jié)合其他治療手段。放療與其他療法的聯(lián)合應(yīng)用早有先例，能夠明顯提高肝癌的治療效果，且減少正常組織的不良反應(yīng)，這其中包括與增敏劑的聯(lián)合、與分子靶向治療聯(lián)合、與基因治療聯(lián)合以及聯(lián)合熱療等[7]。

本文作者前期研究[8-9]結(jié)果顯示：電離輻射可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞G2/M期阻滯，進而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加。在本研究中，2 Gy照射后，肝癌細(xì)胞HepG2增殖被抑制，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，且細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高，說明X射線照射針對肝癌細(xì)胞也具有相似的作用。XAP以通關(guān)藤為原料，利用現(xiàn)代提取技術(shù)提取獲得，臨床主要應(yīng)用于抗癌、消炎和平喘，主要用于食道癌、胃癌、肺癌、大腸癌、宮頸癌和白血病等多種惡性腫瘤的治療，發(fā)揮作用的主要機制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和提高機體免疫力等[10-11]。有研究[12]表明：XAP聯(lián)合化療藥物順鉑能明顯增強其對高轉(zhuǎn)移人卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞的抑制作用，且能促進細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞阻滯，降低侵襲能力。本研究結(jié)果顯示：XAP對人肝癌HepG2細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且與X射線對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用相似，二者聯(lián)合時效果更明顯；但與以往研究不同的是：XAP對HepG2細(xì)胞具有誘導(dǎo)G2/M期阻滯，與鄭愛文等[12]的結(jié)果略有不同，而與趙和平等[13]的研究結(jié)果相似。

針對于XAP和X射線照射均具有凋亡促進作用、且以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為目的的治療方案已成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個熱點[14]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化，同時利用Western blotting法檢測凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3斷裂的情況，結(jié)果顯示：XAP和X射線照射均可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)合能夠使誘導(dǎo)能力大大加強；同時，caspase-3被切割成相對分子質(zhì)量為17 000和19 000的片段，也證明了二者聯(lián)合的凋亡誘導(dǎo)作用。

綜上所述，XAP與X射線照射聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細(xì)胞，具有明顯的細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)作用，且二者聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。但其是否涉及到其他機制，如何發(fā)揮協(xié)同作用，對動物實驗是否具有相似的結(jié)果等問題，仍需進一步探討。本研究結(jié)果為臨床上肝癌的放射治療提供了新的思路和實驗數(shù)據(jù)。

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