程 慧，李詩瑤，彭青枝*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430000）

基于脲酶-金納米棒的雙重放大免疫比色法快速檢測食品中黃曲霉毒素B1

程 慧，李詩瑤，彭青枝*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430000）

該研究提出了一種免疫比色方法用于快速檢測黃曲霉毒素B1。在最優(yōu)條件下，以免疫磁珠為載體，脲酶-金納米棒為探針，探針與抗體特異性結合的同時與尿素反應催化沉積外加銅離子產(chǎn)生的顯色反應為定量基礎，紫外吸收強度作為參考指標，測定樣品中的黃曲霉毒素B1。結果表明，標準曲線的線性回歸方程為Y=4.017+1.430 6X，相關系數(shù)為0.997，檢測限為0.042 ng/mL，加標回收率在92.5%～120.8%之間，表明該方法精密度良好、檢測結果可靠。故該免疫比色法可用于檢測食品中黃曲霉毒素B1。

免疫比色法；金納米棒；脲酶；磁珠；黃曲霉毒素B1

免疫比色法因其方便快捷近年來在真菌毒素檢測方面的應用較為廣泛。在免疫測定系統(tǒng)最重要的問題是采用適當?shù)膫鞲衅鲗⑷趺庖呓Y合信號轉(zhuǎn)化為可測量的信號。與熒光、電化學、電化學發(fā)光和質(zhì)譜分析[1-4]等方法的信號轉(zhuǎn)導相比，比色法因為其簡單、操作方便、低成本和可視化尤其具有吸引力。然而，在免疫比色分析中涉及的主要挑戰(zhàn)是靈敏度的局限性，這導致該分析方法無法實現(xiàn)真菌霉毒素的準確檢測。為了解決這個問題，目前在納米探針信號放大與過氧化物酶催化反應相結合以開發(fā)各種比色信號轉(zhuǎn)導策略。由于過氧化物酶催化底物的特殊顏色變化和多標記納米探針信號放大，許多比色免疫測定方法已成功構建[5-8]。但是，這些催化顯色反應需要外加物以停止反應后獲得相對穩(wěn)定的比色信號。

根據(jù)之前報道合成的腙類銅離子顯色劑可以與銅離子反應生成紅色絡合物，通過紫外-可見吸收光譜法測定該紅色溶液的吸光度值或直接通過目視比色法[9]。金納米棒（gold nanorod，Au NR）可通過控制不同合成條件形成不同的長度-直徑比值，常被用作一種納米載體來制備生物納米探針[9-12]。

本研究制備了一種脲酶（urease）功能化金納米棒探針，并在此基礎上發(fā)展了一種基于脲酶（urease）催化銅離子沉積的新型免疫比色分析方法。金納米探針由金納米棒載體上負載信號抗體和高含量脲酶（urease）制備而成，將其應用于免疫磁珠構建的免疫反應以用于檢測黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）。通過免疫反應定量捕獲的脲酶-金納米棒探針上高含量脲酶標記物可以催化沉積外加的銅離子?；阢~離子和腙類銅離子顯色劑形成的紅色絡合物作為信號轉(zhuǎn)導來源，建立了一種新型比色免疫法用于定量檢測黃曲霉毒素B1。以期為大米及面粉等食品中黃曲霉毒素B1提供一種快速檢測分析方法，進一步加快食品中真菌霉毒素快速檢測的發(fā)展速度。

免疫磁珠的制備過程及其免疫比色分析原理示意如下：

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米樣品：市場抽檢樣品。

黃曲霉毒素B1、赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀烯酮、桔霉素、展青霉毒素標準品（純度≥98%）：北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司；脲酶、抗壞血酸、腙類銅離子顯色劑、疊氮酸鈉（NaN3）、2-嗎啉乙磺酸、乙基-（3-二甲基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、腙類銅離子顯色劑：西格瑪（中國）有限公司；納米磁珠、銅納米粒子：美國量子科學儀器公司；鼠抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體、黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白、驢抗鼠二抗：武漢博士德生物技術有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、聚苯乙烯磺酸鈉、磷酸鹽緩沖溶液、吐溫、四氫呋喃、氯金酸、硼氫酸鈉、硝酸銀、抗壞血酸：上海國藥化學試劑公司；納米磁珠：美國Quantum量子科學儀器公司。

1.2 儀器與設備

JEOL1010型透射電子顯微鏡：日本電子株式會社；UV-3100紫外-可見分光光度計：日本日立公司；AB SCIEX 4500高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜：上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脲酶功能化金納米棒納米探針復合物制備

根據(jù)文獻報道的晶種法制備成實驗所需的金納米棒[13-15]。首先在十二烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）和氯金酸的混合溶液中加入強還原劑硼氫酸鈉制備金種子溶液，再將氯金酸、硝酸銀、十二烷基三甲基溴化銨混合后加入抗環(huán)血酸制備生長液，最后將金種子溶液與生長液混合開始生長金納米棒，48 h后離心除去多余的十六烷基三甲基溴化銨，向所得的5.0mL金納米棒分散液中加入1.0 mg/mL的聚苯乙烯磺酸鈉（sodium polystyrene sulfonate，PSS）1.0 mL，室溫混勻組裝1h。離心除去過量的聚苯乙烯磺酸鈉后，將其分散于1.0mL的磷酸緩沖溶液（pH 6.0）中，依次向其中加入1.0 mg/mL二抗10 μL和5 mg/mL 脲酶20 μL，混勻組裝3 h后4 ℃放置過夜，在此過程中脲酶加入量不變，將二抗的加入量由2 μg、3μg、4μg、5μg、6μg遞增，以此優(yōu)化二抗的用量。之后將所得產(chǎn)物離心洗滌后，分散于5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液中封閉反應1 h。最后，將所得的脲酶功能化金納米棒納米探針經(jīng)離心洗滌，分散于500 μL的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中，4℃保存待用。

1.3.2 免疫磁珠的制備

采用乙基-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亞胺鹽酸鹽（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）/N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）法將納米磁珠的羧基與鼠抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體上的氨基偶聯(lián)[16-17]。2 mg磁珠用500 μL 10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonicacid，MES）和0.05%吐溫20（pH 6.0）混合溶液洗滌兩次，400 μL MES（10 mmol/L，pH 6.0）重懸浮磁珠后加入2 mg/mL EDC/NHS（現(xiàn)配現(xiàn)用），置于渦旋儀上混勻使其充分懸浮，37℃活化30 min。磁分離移除上清，加入500 μL混合洗液洗滌兩次，磷酸鹽-吐溫混合液（pH7.4，含1%BSA）重懸后加入40 μg鼠抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體于4℃混勻過夜，磁分離移除上清，用500 μL磷酸鹽-吐溫（phosphate buffer saline tween，PBST）混合液洗滌4次后重懸于1 mL磷酸鹽-吐溫混合液（pH 7.4，含0.02%NaN3，0.5%牛血清白蛋白），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檢測方法及步驟

向制備的40 μL免疫磁珠中加入100 μL不同濃度的黃曲霉毒素B1標準樣品或樣品提取液，逐級稀釋黃曲霉毒素B1標準品后再加入其中，室溫振蕩15 min后通過磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）和PBST洗凈。向其中加入140 μL脲酶功能化納米探針分散液，繼續(xù)振蕩10 min之后用Tris-HCl（pH 7.4）充分洗凈。加入30 mmol/L的銅離子和40mmol/L尿素溶液，加入110μLpH 7.0含有10 μmol/L腙類銅離子顯色劑的Tris-HCl/四氫呋喃溶液，進行顯色反應得到紅色溶液，通過紫外-可見吸收光譜法測定該紅色溶液的吸光度值，或直接通過目視比色法進行定量分析，記錄不同濃度黃曲霉毒素B1標準品對應的吸光度值以分析免疫反應的性能。

2 結果與分析

2.1 金納米棒的表征

在模板劑十六烷基三甲基溴化銨作用下，利用晶種法制備了金納米棒，為了更好觀察晶種法制備金納米棒的結構及紫外特征吸收峰。由圖1A可知，通過透射電鏡圖觀察到金納米棒呈棒狀結構，并且分布度較好，說明晶種生長法已成功合成金納米棒。而且其紫外-可見吸收光譜在波長512 nm和706 nm處呈現(xiàn)兩個明顯的特征吸收，進一步證明晶種法成功制備了金納米棒材料。

圖1 金納米棒的透射電鏡圖（A）及紫外-可見吸收光譜圖（B）Fig．1 Transmission electron micrograph （A）and UV-visible absorption spectrogram （B）of gold nanorod

2.2 免疫反應影響因素的條件優(yōu)化

圖2 制備納米探針時二抗的用量（A）、底物中尿素濃度（B）、底物中銅離子的用量（C）、免疫反應的時間（D）Fig．2 Second antibody addition （A），urea concentration in substrate （B），the copper ions addition in the substrate （C）and the immune response time （D）in preparation of nanoprobes

基于使磁珠的免疫反應有最佳的酶催化信號轉(zhuǎn)導，實驗分別考察了驢抗鼠二抗的用量對金納米棒納米探針的影響，結果見圖2。由圖2A可知，在抗體用量≤4 μg時，100 ng/mL黃曲霉毒素B1的信號響應隨著抗體用量的增加而不斷增大，直至抗體加入量＞4μg開始緩慢降低。該現(xiàn)象說明加入的抗體量＜4 μg時，不能足夠識別AuNR/Urease納米探針；但是過多的抗體也會影響信號轉(zhuǎn)導。因此，本工作選擇4 μg抗體作為合成納米探針的最佳條件。

由圖2B可知，在尿素濃度≤40 mmol/L時，100 ng/mL黃曲霉毒素B1的信號響應隨其濃度的增加而不斷增大，直到尿素達到40 mmol/L時吸光度的值達到最大值2.0。

由圖2C可知，當銅離子濃度≤30mmol/L時，100ng/mL黃曲霉毒素B1的信號響應隨其濃度的增加而不斷增大，然而，在銅離子濃度為30 mmol/L時的信號響應達到最大值2.0。故本工作選擇40 mmol/L的尿素溶液和30 mmol/L的銅離子作為沉積溶液的最佳組成。

溫育時間是影響免疫分析性能的另一個重要因素。實驗分別研究了不同溫育時間下100 ng/mL黃曲霉毒素B1在免疫磁珠上的信號響應情況。由圖2D可知，夾心免疫反應溫育時間在30～50 min范圍內(nèi)，響應信號不斷增大，直到溫育時間達到50 min后響應基本不變。該結果說明該免疫磁珠在50 min時免疫反應可以達到飽和狀態(tài)，因此實驗選擇50 min作為免疫反應分析的最佳溫育時間。

2.3 分析免疫反應的性能

在最優(yōu)的免疫反應條件下，通過紫外分光光度法考查了不同質(zhì)量濃度黃曲霉毒素B1的響應情況。由圖3可知，吸光度值（Y）與黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度（X）呈較好的線性關系，線性回歸方程為Y=4.017+1.4306X，相關系數(shù)R為0.997，檢測限為0.042 ng/mL，這一結果與之前報道的一些基于酶聯(lián)免疫的分析方法[18-20]相比都要低得多，說明該方法在食品的快速檢測中更具有實際應用意義。

圖3 吸光度值與黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度的關系Fig.3 Relationship between the absorbance and the aflatoxin B1content

2.4 檢測方法特異性、重復性、穩(wěn)定性和可靠性

為了考察該方法的特異性，實驗分別考察了黃曲霉毒素B1、赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀烯酮、桔霉素和展青霉毒素標準品在該免疫磁珠上的信號響應，標準品質(zhì)量濃度分別為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL，經(jīng)免疫磁珠檢測，每個濃度重復3次，判斷免疫磁珠的特異性，結果見表1。與黃曲霉毒素B1在該免疫磁珠上的靈敏信號響應相比，赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀烯酮、桔霉素和展青霉毒素在該免疫磁珠上并沒有引起明顯的信號響應，這一結果說明非特異性真菌霉毒素在該免疫磁珠上引起的交叉反應較小，檢測方法的特異性良好。

表1 特異性試驗結果Table 1 Results of specificity experiments

將同批和不同批次的免疫磁珠分別檢測5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 黃曲霉毒素B1標準品，每個質(zhì)量濃度重復測3次，結果見表2。檢測方法的檢測結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.3%～4.6%，表明該檢測方法具有較好的重復性。

將同一樣品分別放置0、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h后測定一次，分別記錄吸光度值，結果見表3。由表3可知，高質(zhì)量濃度黃曲霉毒素B1標準品（100 ng/mL）與低質(zhì)量濃度黃曲霉毒素B1標準品（1 ng/mL）吸光度值在2.0 h內(nèi)均變化不明顯，由此可以說明樣品溶液在避光冷藏條件下放置2.0 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 重復性試驗結果Table 2 Results of repeatability experiments

表3 穩(wěn)定性試驗結果Table 3 Results of stability experiments

稱取3個未知黃曲霉毒素B1含量的大米各5份進行平行性試驗，結果見表4。由表4可知，3個黃曲霉毒素B1含量不同的樣品平行試驗結果的相對標準偏差均＜10%，結果表明該方法精密度良好。

表4 精密度試驗結果Table 4 Results of precision experiments

表5 加標回收試驗結果Table 5 Results of adding recovery rate experiments

在大米樣品中添加一定含量的黃曲霉毒素B1標準品，使最終質(zhì)量濃度為2 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL。經(jīng)提取回收，將高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、酶聯(lián)免疫試劑盒所得分析結果與免疫比色法分析結果相比較，結果見表5。由表5可知，免疫比色法的回收率在92.5%～120.8%，表明將該方法用于實際樣品分析具有良好的可靠性和準確度。

3 結論

本研究建立了一種基于脲酶功能化金納米棒探針催化銅離子的一種新型免疫比色法用于檢測大米中黃曲霉毒素B1。通過在磁珠上共價固定捕獲抗體，免疫反應后定量捕獲到免疫磁珠表面的金納米探針可誘導沉淀外加的銅離子。金納米棒納米載體上負載的高含量脲酶標記物的酶催化作用和磁珠表面組裝的抗體均可大大增強分析信號，從而使得該方法可得到較高的靈敏度和較寬的線性范圍。標準曲線及方法學驗證結果顯示，方法的最低檢測限為0.042 ng/mL，免疫比色法的標準線性回歸方程Y=4.017+1.4306X，相關系數(shù)R=0.997；精密度試驗結果RSD為1.42%～6.41%，加標回收率為92.5%～120.8%，溶液在避光冷藏放置2 h內(nèi)穩(wěn)定，免疫比色法檢測結果與GB 5009.22—2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》液相色譜法及酶聯(lián)免疫法試劑盒法的檢測結果無顯著性差異（P＞0.05）。結果表明該免疫比色法在實際應用中具有較好的發(fā)展前景。

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Rapid detection of aflatoxin B1in food by dual-amplified immuocolorimetry based on urease-functionalized gold nanorods

CHENG Hui,LI Shiyao,PENG Qingzhi*
（Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test,Wuhan 430000,China）

A kind of immuocolorimetry for rapid detection of aflatoxin B1was established.Using immune magnetic beads as the carrier,urease-gold nanorods as the probe,probe and antibody specificity combined with urea reaction catalytic deposition and copper ion chromogenic reaction as the quantitative foundation,the intensity of ultraviolet absorption as reference index,the aflatoxin B1in the sample was detected under the optimal conditions.The results showed that the linear regression equation of the standard curve wasY=4.017+1.430 6X,the correlation coefficient was 0.997,the limit of detection was 0.042 ng/ml,the adding standard recovery rate was 92.5%-120.8%.It indicated that the method had good precision and reliable test results,which could be used for detection of aflatoxin B1in food.

immuocolorimetry;gold nanorods;urease;magnetic bead;aflatoxin B1

TS207.5

0254-5071（2017）12-0158-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.033

2017-09-12

國家自然科學基金項目（No.21475033）

程 慧（1989-），女，助理工程師，碩士，研究方向為食品檢測。

*通訊作者：彭青枝（1967-），女，研究員，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。