尹 亮，李雙鈴，任 艷，石延茂，袁 美

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

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42個(gè)花生品種的SSR標(biāo)記指紋圖譜構(gòu)建

尹 亮，李雙鈴，任 艷，石延茂，袁 美*

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

以不同地區(qū)的42個(gè)花生品種為材料，利用23對(duì)SSR引物進(jìn)行分析。23對(duì)SSR引物在42個(gè)花生品種中共檢測到92個(gè)等位變異，平均每對(duì)引物4個(gè)等位基因，平均PIC值為0.49。進(jìn)一步分析表明，8對(duì)引物就可以將42個(gè)花生品種完全區(qū)分開，8對(duì)引物共產(chǎn)生40個(gè)等位變異，利用這40個(gè)等位變異構(gòu)建了42個(gè)花生品種的DNA指紋圖譜。聚類分析結(jié)果顯示，在相似系數(shù)0.74處，可將42個(gè)供試品種分為4個(gè)類群。本研究結(jié)果為花生品種保護(hù)和育種實(shí)踐提供了理論依據(jù)。

花生；SSR；DNA指紋圖譜；聚類分析

花生(ArachishypogaeaL.)是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。近年來，隨著大量花生新品種的推廣與應(yīng)用，以及在育種過程中高頻率使用少數(shù)骨干親本，造成花生品種遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄，遺傳多樣性降低，使以形態(tài)性狀鑒定為主的傳統(tǒng)品種鑒定方法已經(jīng)很難滿足現(xiàn)在的生產(chǎn)需要。以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜技術(shù)的出現(xiàn)為品種鑒定提供了新的快捷途徑。目前，用于DNA指紋圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR和STS等[1]。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相比，DNA指紋圖譜技術(shù)具有簡單、快速、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已在水稻[2]、玉米[3]、大豆[4]、棉花[5]、高粱[6]等農(nóng)作物品種鑒定及遺傳分析中得到廣泛使用。

在花生品種鑒定研究方面，已有多家單位構(gòu)建了特定類型或部分區(qū)域的花生主栽品種的DNA指紋圖譜。翁躍進(jìn)等[7]利用AFLP技術(shù)對(duì)從國際半干旱所引進(jìn)的9份花生抗旱品種繪制指紋圖譜；李雙鈴等[8]利用MseI和EcoRI酶切和9對(duì)引物組合構(gòu)建了10個(gè)山東花生主栽品種的AFLP指紋圖譜。近年來，隨著花生SSR標(biāo)記引物的不斷開發(fā)[9-13]，其以數(shù)量豐富、共顯性遺傳、信息含量高、結(jié)果重現(xiàn)性好、檢測手段簡便易行等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為構(gòu)建花生品種DNA指紋圖譜的主要分子標(biāo)記。國內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道，已利用SSR分子標(biāo)記分別構(gòu)建了20個(gè)南方花生品種[14]、40個(gè)珍珠豆型花生品種[15]、山東審定的46個(gè)花生品種[16]以及河南審定的90個(gè)花生品種[17]的指紋圖譜。此外，任小平等[18]利用SSR熒光引物構(gòu)建了100份花生的指紋圖譜。本研究利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了不同地區(qū)的42個(gè)花生品種的DNA指紋圖譜，并對(duì)SSR標(biāo)記多態(tài)性進(jìn)行分析，為品種保護(hù)和育種實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用來自山東、四川、河南、河北、廣東、福建等省的42個(gè)品種為材料(表1)。所有花生材料均種植于山東省花生研究所萊西試驗(yàn)農(nóng)場。

1.2 DNA提取

選取花生幼嫩健康葉片，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取花生葉片基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測DNA純度及濃度，并將DNA稀釋為30ng/μL。

1.3 SSR標(biāo)記分析

選取經(jīng)本研究組初篩具有多態(tài)性的23對(duì)SSR引物(表2)對(duì)42份花生品種進(jìn)行檢測。SSR引物序列均來源于Peanut Marker Database網(wǎng)站(http://marker.kazusa.or.jp/peanut/#)，引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)使用MDBIO(青島)的Taq DNA聚合酶，反應(yīng)體系參照說明書。PCR反應(yīng)條件為：95℃下變性3min；95℃下30s，55℃下30s，72℃下30s，30個(gè)循環(huán)；72℃下延伸3min。PCR產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，方法參考鄭永勝等的方法[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分別以0和1記載各品種SSR等位變異，在相同遷移率位置上，有帶記為1、無帶記為0，位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失記為9，組成原始矩陣。利用SSR數(shù)據(jù)處理宏程序DataTrans 1.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，并使用PowerMarker V3.25對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行分析，計(jì)算出每個(gè)SSR標(biāo)記的主基因頻率、基因型數(shù)、等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、雜合度以及PIC值。使用NTSYS-pc 2.10e軟件的SAHN程序和UPGMA方法對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖并計(jì)算出各品種間的遺傳相似系數(shù)。

表1 試驗(yàn)材料及來源

表2 引物及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

對(duì)23對(duì)SSR引物的電泳圖譜進(jìn)行分析(圖1)，在42個(gè)花生品種中共檢測到92個(gè)等位變異，其中每個(gè)標(biāo)記等位基因數(shù)3～8個(gè)，平均每個(gè)標(biāo)記4個(gè)等位基因，其中AHGS1446和TC23H10分別檢測到8個(gè)和7個(gè)等位變異；引物PIC值為0.27～0.76，平均0.49，PIC值超過0.5的引物有10對(duì)，其中AHGS1446、TC23H10、GNB827的PIC值超過0.7，GNB613和Seq11G07的PIC值最低，為0.27；引物基因多樣性指數(shù)為0.32～0.79(表3)；主基因頻率為0.29～0.83；IPAHM455、PM183、Seq2G03、Seq3A08、Seq16F01、Seq18C05在1個(gè)品種中存在雜合位點(diǎn)，GNB317、GNB613、Seq19B12在2個(gè)品種中存在雜合位點(diǎn)。綜合分析比較各參數(shù)，PIC值變化趨勢與基因多樣性指數(shù)變化趨勢一致，PIC值越高則該引物對(duì)于不同品種的鑒別能力越強(qiáng)。

圖1 引物AHGS1446和AHGS2535在42個(gè)花生品種中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 DNA fragments amplified by SSR primers AHGS1446 and AHGS2535 among 42 peanut varieties注：A：AHGS1446；B：AHGS2535；1～42：對(duì)應(yīng)供試材料編號(hào)，編號(hào)與表1相同。Note: A: AHGS1446; B: AHGS2535; 1～42: The code of varieties corresponding with those in Table 1.

表3 SSR引物擴(kuò)增等位基因數(shù)及多態(tài)性信息

表4 8個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建的42個(gè)花生品種的指紋圖譜

2.2 42個(gè)花生品種DNA指紋圖譜構(gòu)建

采用23對(duì)SSR引物對(duì)42個(gè)花生品種進(jìn)行指紋分析，遠(yuǎn)雜9102、鄭農(nóng)花12、冀花2號(hào)在引物AHGS1446檢測圖譜中有特征譜帶，中花9號(hào)、中花15在引物IPAHM352檢測圖譜中有特征譜帶，仲愷花1號(hào)在引物PM183和Seq3A01檢測圖譜中均有特征譜帶，山花10號(hào)、遠(yuǎn)雜9102在引物TC23H10檢測圖譜中有特征譜帶。除上述少數(shù)品種外，其他品種都不具有特征譜帶，因此需要利用引物組合進(jìn)行鑒定。通過分析，僅需要8對(duì)引物AHGS1446、AHGS1661、GNB827、IPAHM455、PM183、Seq3A01、TC23H10、TC25G11進(jìn)行組合，即可將42個(gè)花生品種完全區(qū)分開。利用上述8對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建42個(gè)花生品種的DNA指紋圖譜(表4)。

圖2 42個(gè)花生品種的UPGMA聚類分析 Fig.2 UPGMA clustering of 42 peanut varieties

2.3 42個(gè)花生品種特異性分析

利用23對(duì)引物擴(kuò)增得到的92條多態(tài)性條帶進(jìn)行聚類分析，得到供試材料的遺傳關(guān)系樹狀圖(圖2)。結(jié)果表明，所有供試品種間差異位點(diǎn)數(shù)均≥2，其中山花8號(hào)與山花10號(hào)、豫花15與冀0212-4、鄭農(nóng)花12與鄭農(nóng)花13相似系數(shù)較高，僅有2對(duì)引物可以將其分開。在相似系數(shù)0.74處，可以將42個(gè)花生品種分為4個(gè)類群。第I類群包含17個(gè)花生品種，分別為花育56、花育45、山花8號(hào)、山花10號(hào)、花育33、豫花15、冀0212-4、豫花9620、鄭農(nóng)花13、鄭農(nóng)花12、濰花9號(hào)、冀0607-17、豫花9306、天府23、豫花9925、中花8號(hào)和徐花9號(hào)。第II類群包含17個(gè)花生品種，分別為花育31、山花12、鐵花15、山花15、?；?號(hào)、濮花30、駐29150、遠(yuǎn)雜9102、天府20、山花9號(hào)、中花9號(hào)、濮花22、冀花2號(hào)、濮花28、中花15、山花7號(hào)和豐花1號(hào)。第III類群包含2個(gè)花生品種，分別是中花12和中花5號(hào)。第IV類群包含6個(gè)花生品種，分別是仲愷花1號(hào)、泉花865、閩花6號(hào)、泉花327、仲愷花10號(hào)和仲愷花12。

3 討論與結(jié)論

SSR(Simple Sequence Repeat)，簡單序列重復(fù)，又稱為微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)或短串聯(lián)重復(fù)(STR)，是一種真核生物基因組中普遍存在的重復(fù)序列。Zhao等[20]研究表明，在9274對(duì)已開發(fā)的SSR分子標(biāo)記中，1323對(duì)具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為14.5%。SSR標(biāo)記因其在基因組分布廣泛、多態(tài)性高以及共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，是構(gòu)建DNA指紋圖譜的理想技術(shù)。本研究首先從實(shí)驗(yàn)室已篩選出的200余對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物中選出23對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定、帶型簡單清晰的SSR引物對(duì)42個(gè)不同地區(qū)花生品種進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明所有品種均有2個(gè)或2個(gè)以上差異位點(diǎn)，其中遠(yuǎn)雜9102、鄭農(nóng)花12、冀花2號(hào)、中花9號(hào)、中花15、仲愷花1號(hào)、山花10號(hào)7個(gè)品種可以用單一引物進(jìn)行區(qū)分，其他品種用8對(duì)引物進(jìn)行組合就可以全部區(qū)分開，并構(gòu)建了42個(gè)花生品種DNA指紋圖譜。從聚類分析結(jié)果來看，同一地區(qū)及同一育種單位培育的花生品種相似系數(shù)較高，這與各地區(qū)、各育種單位在育種過程中高頻使用少數(shù)骨干親本有關(guān)，導(dǎo)致花生品種遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄[21-22]。本研究結(jié)果為品種保護(hù)和育種實(shí)踐提供了理論依據(jù)。

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Construction of Molecular Fingerprint for 42 Peanut Varieties Using SSR Markers

YIN Liang, LI Shuang-ling, REN Yan, SHI Yan-mao, YUAN Mei*

(Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China)

42 peanut varieties from different area of China were used as materials. The varieties were analyzed by using 23 pairs of polymorphic SSR primers. A total 92 alleles were amplified from 23 SSR loci. The average of alleles is 4, and the average of polymorphic information content (PIC) is 0.49. Further analysis showed that, only 8 pairs of primer can fully distinguish 42 peanut varieties. A total 40 alleles were amplified from these 8 pairs of primers. The fingerprint clustering analysis of 42 peanut varieties was constructed by 40 alleles. Cluster analysis revealed that 42 peanut varieties could be classified into four groups at a 0.74 genetic similarity coefficient.This result provide theoretical basis for peanut varieties protection and breeding improvement.

peanut; SSR; DNA fingerprinting; clustering analysis

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.01.002

2017-02-16

國家自然科學(xué)基金(31471533)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃(2013AA102602-7)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2016B02)

尹亮(1983-)，男，山東膠南人，山東省花生研究所助理研究員，碩士，從事花生遺傳育種研究。

*通訊作者：袁美(1972-)，女，研究員，博士，主要從事花生生物技術(shù)研究。E-mail: yuanbeauty@163.com

S565.2024; Q755

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