袁玉菊，張倩穎，曾麗云，張文學(xué),2*

1(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都，610000)2(四川大學(xué) 錦江學(xué)院 白酒學(xué)院，四川 眉山，620860)

不同性狀窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與酸酯含量分析

袁玉菊1，張倩穎1，曾麗云1，張文學(xué)1,2*

1(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都，610000)2(四川大學(xué) 錦江學(xué)院 白酒學(xué)院，四川 眉山，620860)

為了解不同性狀窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及酸酯代謝的差異，分別選取新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥，對其細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析和同源性比較，并結(jié)合窖泥主要有機(jī)酸及有機(jī)酸酯含量進(jìn)行了典型相關(guān)分析。結(jié)果表明，老熟窖泥的細(xì)菌多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)高于新窖泥和趨老熟窖泥，得到的39個(gè)優(yōu)勢條帶，進(jìn)行細(xì)菌DNA測序可分為14類；ClostridiumXIVa、Aminobacterium均只在老熟窖泥中檢測到；新窖泥和趨老熟窖泥與Lactococcus、Lactobacillus、乳酸、乳酸乙酯含量正相關(guān)，老熟窖泥與Clostridiales、己酸、己酸乙酯和丁酸含量正相關(guān)。

窖泥；細(xì)菌群落；變性梯度凝膠電泳(denaturing gel gradient electrophoresis,DGGE)；酸酯含量

中國白酒歷史悠久，其中濃香型白酒產(chǎn)量最大，酒廠主要集中在四川一帶，以特色的封閉泥窖作為發(fā)酵容器，采用混蒸混燒工藝，素有千年窖池萬年糟的說法，隨著窖池使用時(shí)間的增長，不斷地封窖、發(fā)酵、開窖，逐漸形成了一個(gè)龐大且獨(dú)特的微生物體系[1]。生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)表明，窖泥作為此體系的主要載體，其品質(zhì)和酒質(zhì)密切相關(guān)，白酒釀造過程中，細(xì)菌對其香氣成分的構(gòu)成起著相當(dāng)重要的作用。正常情況下，隨著窖泥逐漸老熟，其白酒的質(zhì)量也趨于優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定，窖泥中的微生物群落也在發(fā)生著變化，有益微生物逐漸累積，更利于好酒的產(chǎn)出。但窖泥自然老熟過程緩慢，易受到環(huán)境因素的影響。因此，探究新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥的細(xì)菌群落差異，了解其與主要有機(jī)酸及有機(jī)酸酯含量的相關(guān)性，對于定向促進(jìn)新窖的老熟，維護(hù)窖泥的穩(wěn)定具有重要意義。

窖池是一個(gè)封閉的厭氧系統(tǒng)，很多微生物難以培養(yǎng)，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)存在著一定局限性，因此克隆文庫、變性梯度凝膠電泳(denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE)、高通量測序等免培養(yǎng)分子技術(shù)被越來越多地用于窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，其中PCR-DGGE技術(shù)快速、易操作，準(zhǔn)確性高，能克服傳統(tǒng)微生物研究方法的不足，得到廣泛應(yīng)用[2]。本研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合典型相關(guān)分析方法對新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥的細(xì)菌群落及酸、酯含量進(jìn)行初步探討，以期更多地了解不同性狀窖泥中細(xì)菌群落、主要有機(jī)酸、有機(jī)酸酯之間的差異及其窖泥特征性，從而能更好地把控濃香型白酒生產(chǎn)過程，使其處于較優(yōu)的穩(wěn)定狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年11月取自四川西部某酒廠，6個(gè)樣品均為窖底泥，新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥主要結(jié)合窖池投產(chǎn)時(shí)間以及所產(chǎn)白酒酒質(zhì)判斷，各性狀窖泥采集2窖池作為平行，編號分別為新窖泥(1a和1b，5年窖池)、趨老熟窖泥(2a和2b，10年窖池)、老熟窖泥(3a和3b，50年窖池)，采用五點(diǎn)取樣法取樣，混合均勻后用冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即提取總DNA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥樣品總DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek，USA)提取窖泥樣品總DNA。用引物[3]P2(5′-ATTACC GCGGCTGCTGG-3′)和 P3(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGG￣G￣C￣G￣G￣G￣G￣C￣G￣G￣GGGCACGGGGGGCCT AC￣G￣G￣G￣A￣G￣G￣C￣A￣G￣C￣A￣G-3′)對細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，得到片段大小約為233 bp。PCR反應(yīng)體系參考LIANG[4]。擴(kuò)增用touch-down程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃；最終94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)。所得PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 窖泥酸、酯的色譜檢測

取10 g窖泥，用體積分?jǐn)?shù)為15%的甲醇溶液定容至100 mL，30 ℃超聲40 min，0.45 μm孔徑濾膜過濾后得到窖泥浸提液待測。

采用氣相色譜(安捷倫7890)檢測窖泥提取液的己酸、丁酸、乙酸、己酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯。氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量0.5 μL，柱箱初始溫度40 ℃，保持5 min，然后5 ℃/min升到80 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min升到120 ℃，保持0 min，再以15 ℃/min升到210 ℃，保持12 min。

采用安捷倫1260液相色譜儀和安捷倫6430A質(zhì)譜檢測器檢測乳酸，流動相為甲醇和水(60∶40，體積比)，每次進(jìn)樣5 μL，分析時(shí)間為5 min，流量為2 mL/min，色譜柱為XDB-C18(4.6 mm×50 mm)，選擇離子法掃描，選擇離子為89.1。

1.2.3 16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物梯度變性凝膠電泳

細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增片段通過DGGE(Bio-Rad)分析其細(xì)菌群落，丙烯酰胺膠濃度為8%，變性梯度范圍為30%～55%(100%變性劑為7 mol/L 尿素和40%去離子甲酰胺)，上樣量為40 μL，在1×TAE中，100 V，60 ℃條件下電泳220 min[4]。電泳結(jié)束后用SYBR Green I(1∶50 000)染色45 min。通過紫外成像系統(tǒng)獲取圖像，對優(yōu)勢條帶切膠回收后送至生工測序，測得序列通過GenBank 進(jìn)行BLAST同源性比對。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用分析軟件(Quantity One，Bio-Rad)對DGGE圖譜圖像進(jìn)行預(yù)處理去除背景，根據(jù)條帶的光密度值對圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行量化，據(jù)此計(jì)算Simpson指數(shù)、Shannon-wiener指數(shù)與均勻度指數(shù)，以反映群落種類多樣性及個(gè)體分布的均勻性，計(jì)算方法如下：

Simpson指數(shù)：D=1-ΣPi2

Shannon-wiener指數(shù)：H′=-ΣPilnPi

均勻度指數(shù)：E=H/Hmax，

式中：Pi，種的個(gè)體數(shù)占群落中總個(gè)體數(shù)的比例；H，實(shí)際觀察的物種多樣性指數(shù)；Hmax，最大的物種多樣性指數(shù)，Hmax=lnS(S為群落中的總物種數(shù))。

同時(shí)采用WPGAMA算法進(jìn)行聚類分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹。

典型相關(guān)分析是一種研究兩組變量之間相關(guān)關(guān)系的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，以DGGE 圖譜量化后的細(xì)菌含量數(shù)據(jù)作為種變量，以標(biāo)準(zhǔn)化處理后的酸酯含量作為環(huán)境變量，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Canoco for windows進(jìn)行典型相關(guān)分析(CCA)，研究不同性狀的窖泥樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和酸酯含量之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 DGGE圖譜分析

從圖1的DGGE指紋圖譜，結(jié)合Quantity One分析可知，條帶4、5、23、24、34和39均只在老熟窖泥中檢測到，新窖泥和趨老熟窖泥樣品中條帶10和14的亮度明顯大于老熟窖泥，說明窖泥逐漸老熟中，細(xì)菌種類及優(yōu)勢菌群都發(fā)生著變化。

圖1 新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥細(xì)菌16S rDNA的PCR-DGGE圖譜及條帶系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 PCR-DGGE fingerprints and cluster analysis of 16S rDNA extracted from bacterial community in new, trend to be aging and aging pit mud

結(jié)合表1可知，窖泥老熟過程中，細(xì)菌多樣性指數(shù)呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢，均勻度指數(shù)也逐漸上升，說明窖泥中的細(xì)菌群落逐漸達(dá)到一個(gè)穩(wěn)態(tài)，且細(xì)菌群落變化是一個(gè)復(fù)雜且緩慢的過程[5]。

表1 新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

Table 1 Diversity of 16S rDNA extracted from bacterial community in new , trend to be aging and aging pit mud

樣品simpson指數(shù)(D)Shannon-wiener指數(shù)(H')均勻度指數(shù)(E)3a0.95573.3050.77283b0.94543.1170.72822a0.93903.0520.7052b0.93783.0160.68011a0.92052.9440.63281b0.92862.9440.6129

從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，老熟窖泥明顯與新窖泥、趨老熟窖泥分開，單獨(dú)成一簇，新窖泥和趨老熟窖泥聚成一大簇，又各分為兩簇，說明老熟窖泥細(xì)菌群落與新窖泥、趨老熟窖泥有較大區(qū)別，新窖泥和趨老熟窖泥在細(xì)菌群落進(jìn)化上有一定差異，但與老熟窖泥相比新窖泥和趨老熟窖泥更為接近。王海英[6]等人提出50年是窖池細(xì)菌群落進(jìn)化的一個(gè)分界線，本文中老熟窖泥樣品為50年窖泥，進(jìn)一步證實(shí)了該看法?？赡苁窃诮涯嗬鲜爝^程中，由細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的量變逐漸引起窖泥性狀的改變，直至達(dá)到細(xì)菌群落進(jìn)化的質(zhì)變，窖泥呈現(xiàn)老熟狀態(tài)，從而與新窖泥和趨老熟窖泥狀態(tài)發(fā)生了明顯差別。

2.2 優(yōu)勢條帶測序分析

切取DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶，測序后經(jīng)NCBI和RDP同源性比對，結(jié)果如表2所示，共得到14類，窖泥中細(xì)菌主要為擬桿菌目，梭菌目和乳桿菌目。其中，條帶4(ClostridiumXIVa)、5(unclassified Bacteroidetes)、23(unclassified Syntrophomonadaceae)、34(Aminobacterium)和條帶24、39(unclassified Clostridiales)只在老熟窖泥中檢測到。ClostridiumXIVa、Aminobacterium等似乎可成為潛在的老熟窖泥指針菌，LIU[7]等研究結(jié)果顯示Aminobacterium具有降乳酸的功能。結(jié)合DGGE圖譜條帶光密度可以看出，老熟窖泥中Lactococcus(條帶1和2)與Lactobacillus(條帶12、14和15)含量低于新窖泥和趨老熟窖泥，這與TAO[8]等的研究結(jié)果類似。有研究表明，Lactobacillus(條帶1、2、12、14、15和21)最終產(chǎn)物是乳酸，大量乳酸的存在會抑制己酸的合成[9]。另外，Clostridiales目各類梭菌在老熟過程是逐漸增加的，據(jù)報(bào)道梭菌對濃香型白酒香氣的形成起著非常重要的作用，其主要代謝產(chǎn)物是己酸、丁酸和氫[10]，WEINER報(bào)道的Clostridiumkluyceri的己酸產(chǎn)量更是達(dá)到了12.9 g/L[11]。濃香型大曲酒的主體香是己酸乙酯，乳酸和乳酸乙酯也是白酒風(fēng)味的重要組分，但過量乳酸和乳酸乙酯對出酒率和白酒風(fēng)味質(zhì)量有嚴(yán)重影響[12]，因此，新窖泥與趨老熟泥的乳酸菌高于老窖泥可能是導(dǎo)致老窖酒的口感普遍優(yōu)于新窖酒的原因。

此次還檢測到了Petrimonas屬(條帶7、13、17、18和20)和unclassified Syntrophomonadaceae(條帶23和27)，Petrimonas可以利用葡萄糖產(chǎn)生乙酸、H2和CO2等[1,11]。Syntrophomonas與甲烷菌共生時(shí)可產(chǎn)生乙酸和H2，而甲烷菌正好可以利用乙酸和H2[8,12,14]，此類種間氫轉(zhuǎn)移來控制氫氣分壓有利于己酸的形成。

表2 細(xì)菌16S rDNA 的DGGE優(yōu)勢條帶測序結(jié)果

2.3 窖泥細(xì)菌群落和酸、酯含量的典型相關(guān)分析

新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥的酸、酯含量檢測結(jié)果如表3所示，結(jié)合酸、酯含量與細(xì)菌群落進(jìn)行典型相關(guān)分析(CCA)，結(jié)果如表4。

根據(jù)表4典型相關(guān)分析結(jié)果，典型變量1和典型變量2解釋了樣本中82.9%的變異，前4個(gè)典型變量共解釋了98.8%的樣本總變異，4個(gè)典型變量的種-環(huán)境相關(guān)系數(shù)為1，說明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與本實(shí)驗(yàn)所檢測的酸、酯存在極強(qiáng)的相關(guān)性。根據(jù)典型變量1和2生成二維排序圖(圖2)，典型變量1和典型變量2、與酸、酯的相關(guān)系數(shù)如表5所示，其中相關(guān)性較高的有己酸乙酯、己酸、丁酸、乳酸和乳酸乙酯。

表3 窖泥提取液酸、酯檢測結(jié)果

表4 典型相關(guān)分析結(jié)果

表5 典型變量與酸、酯的相關(guān)系數(shù)

從排序圖可以看出，老熟窖泥(3a和3b)與己酸、己酸乙酯和丁酸呈正相關(guān)，與乳酸及乳酸乙酯呈負(fù)相關(guān)，圖1系統(tǒng)發(fā)育樹中3a和3b聚為一類，但在典型變量1軸上比較接近，在典型變量2軸上相距較遠(yuǎn)，可能是CCA分析中，Syntrophomonadaceae、Synergistaceae和Lachnospiraceae對典型變量2 貢獻(xiàn)大，而2個(gè)樣品中這3個(gè)細(xì)菌含量有一定差異引起的。新窖泥(1a和1b)與趨老熟窖泥(2a和2b)則可以歸為一大類，與乳酸和乳酸乙酯正相關(guān)，與己酸、己酸乙酯及丁酸負(fù)相關(guān)。造成新窖泥及趨老熟窖泥與老熟窖泥有此相反結(jié)果的原因可能是新窖泥及趨老熟窖泥中可以產(chǎn)乳酸Lactococcus與Lactobacillus含量較高，而老熟窖泥中可以產(chǎn)己酸的Clostridiales、具有降乳酸功能的Aminobacterium含量較高。綜合優(yōu)勢條帶微生物及其可能產(chǎn)物的分析，可以大致認(rèn)為，Streptococcaceae(Lactococcus與Lactobacillus)是新窖泥與趨老熟窖泥的典型微生物，Clostridiaceae是老熟窖泥的典型微生物。

圖2 新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥CCA分析圖Fig.2 Canonical correlation analysis of new,trend to be aging and aging pit mud

3 結(jié)論

此次對新窖泥、趨老熟窖泥和老熟窖泥細(xì)菌群落的PCR-DGGE及與有機(jī)酸、有機(jī)酸酯的典型相關(guān)分析表明，新窖泥、趨老熟窖泥有較大的相似性，老熟窖泥則與新窖泥、趨老熟窖泥有明顯的差別，前者具有更高的細(xì)菌群落穩(wěn)定性和群落均勻性。老熟窖泥與己酸、己酸乙酯及丁酸含量呈正相關(guān)，與乳酸及乳酸乙酯含量呈負(fù)相關(guān)，新窖泥、趨老熟窖泥則相反，這可能正好是老窖酒口感優(yōu)于新窖酒的原因。Lactococcus與Lactobacillus對新窖泥、趨老熟窖泥貢獻(xiàn)較大，而Clostridiales對老熟窖泥貢獻(xiàn)較大；ClostridiumXIVa、Aminobacterium均只在老熟窖泥中檢測到，可考慮進(jìn)一步探討其成為潛在的老熟窖泥指針菌的可能性。

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Analysis of bacterial community and acid, ester contents in pit mud with different characteristics

YUAN Yu-ju1, ZHANG Qian-ying1,ZENG Li-yun1,ZHANG Wen-xue1,2*

1(College of Light Industry, Textile and Food Engineering, Sichuan University, Chengdu 610000,China) 2(School of Liquor-making Engineering, Jinjiang College, Sichuan University, Meishan 620860,China)

To further understand bacterial community structure, metabolism of acids and esters differences among new, aging and aged pit mud of Chinese Luzhou-flavor liquor, V3 region of bacterial 16S rDNA and the major organic acids and esters in pit mud were analyzed through a combination of PCR-DGGE and canonical correlation analysis. The results showed that the bacterial diversity index and evenness index of aged pit mud were higher than those of the others. 39 preponderant bands were obtained, which could be divided into 14 categories by sequencing.ClostridiumXIVa andAminobacteriumwere only detected in aged pit mud. New and aging pit mud were positive correlation with contents ofLactococcus,Lactobacillus, lactic acid and ethyl lactate, while aged pit mud was positive correlation with contents of Clostridiales, caproic acid, butyric acid and caproate.

pit mud; bacterial community;denaturing gel gradient electrophoresis(DGGE);acid and ester contents

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701008

碩士研究生(張文學(xué)教授為通訊作者,E-mail：foodecoengineering@163.com)。

基于風(fēng)味指紋圖譜的濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵微生物強(qiáng)化共培養(yǎng)技術(shù)研究及應(yīng)用(其他)(014CDDY-S03-SCU)

2016-07-27，改回日期：2016-09-06