王曉姣，張震宇，孫付保，于林

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

精氨酸缺陷型菌株發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸

王曉姣，張震宇*，孫付保*，于林

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

為了獲得高產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的菌株，基于大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)模型的指導(dǎo)，以大腸桿菌E.coliBL21(DE3)ΔputA為出發(fā)菌株，通過基因敲除技術(shù)成功敲除argB基因，阻斷L-脯氨酸合成的前體物L(fēng)-谷氨酸的分支代謝途徑，增加L-脯氨酸合成的代謝流，構(gòu)建了精氨酸缺陷型菌株E.coliBL21(DE3)ΔputAΔargB。同時(shí)轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp，該質(zhì)粒含有突變基因proB2，該突變基因所編碼的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反饋抑制作用顯著降低。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，在外源添加600 mg/LL-精氨酸時(shí)，該重組菌株產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的量達(dá)到312.67 mg/L，較菌株E.coliBL21(DE3)ΔputA/pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。

大腸桿菌1；反式-4-羥脯氨酸2；基因敲除3；脯氨酸4

反式-4-羥脯氨酸(trans-4-hydroxyproline，Hyp)為亞氨基酸，是L-脯氨酸經(jīng)反式-4-羥化酶(proline-4-hydroxylase,hyp) 羥基化的產(chǎn)物，歸屬高附加值小品種氨基酸類[1]。Hyp在食品營(yíng)養(yǎng)、化工生產(chǎn)、護(hù)膚美容業(yè)以及醫(yī)藥保健具有廣泛的應(yīng)用[2-3]。由于其潛在的醫(yī)藥、食品價(jià)值以及市場(chǎng)需求，促進(jìn)了反式-4-羥脯氨酸的研究步伐。

脯氨酸作為羥脯氨酸合成的底物，前期實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)合成羥脯氨酸都需要外源添加脯氨酸[4-5]。脯氨酸的添加不僅導(dǎo)致生物法合成羥脯氨酸的成本大大提高，而且外源添加的脯氨酸大部分并不能被微生物所利用，造成了資源的浪費(fèi)。

基于對(duì)代謝調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)，可以在基因水平和酶學(xué)水平上對(duì)Hyp的合成途徑進(jìn)行理性操作。目的產(chǎn)物的積累一般有2種方式，積累關(guān)鍵前體和降低副產(chǎn)物生成：L-谷氨酸是L-脯氨酸生物合成的前體物質(zhì)，同時(shí)也是L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸生物合成的前體物質(zhì)，其胞內(nèi)濃度決定了L-脯氨酸的合成速率[6]。因此，削弱競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑，阻斷L-谷氨酸到L-精氨酸的合成代謝流，使得L-谷氨酸到L-脯氨酸合成分支代謝流量增強(qiáng)，使得碳源、氮源等更多的用于脯氨酸的合成，可以提高L-脯氨酸的產(chǎn)量[7]。谷氨酸是脯氨酸和精氨酸的共同前體物(圖1)。為提高脯氨酸的產(chǎn)量可以采用基因敲除等方法切斷谷氨酸合成精氨酸的途徑，從而為脯氨酸的生產(chǎn)提供更多的原料。N-乙酰谷氨酸激酶(N-Acetylglutamate kinase EC 7 2.8，NAGK)，是精氨酸合成途徑的第2個(gè)酶。該酶由argB基因編碼，是精氨酸途徑中的關(guān)鍵酶。該酶不僅被精氨酸反饋抑制而且也被其反饋?zhàn)瓒鬧8-9]，而且是精氨酸生產(chǎn)過程中被精氨酸抑制的唯一限速酶。本文選擇敲除精氨酸代謝途徑中的argB基因，切斷精氨酸代謝途徑，使得脯氨酸大量積累，從而獲得羥脯氨酸高產(chǎn)菌株。

圖1 大腸桿菌中反式-4-羥脯氨酸生物合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathways of Hyp in E. coli

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)用到的菌株[5]及質(zhì)粒[10]見表1，其中E.coliBL21(DE3)作為宿主，質(zhì)粒pUC19作為基因表達(dá)載體。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒

1.1.2 試劑及儀器

葡萄糖、NaCl、MgSO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、瓊脂粉、CaCl2、FeSO4、正丙醇、氯胺T、高氯酸、對(duì)二甲氨基苯甲醛、異丙醇、NH4Cl等購(gòu)自上海國(guó)藥。胰蛋白胨、酵母抽提物、瓊脂糖、氨芐青霉素鈉、硫酸卡那霉素、氯霉素、TaqDNA聚合酶、PfuDNA 聚合酶、dNTP Mixture、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒等購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶，DNA Marker，購(gòu)自寶生物公司(中國(guó)，大連)。

主要儀器包括培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、分光光度計(jì)、電轉(zhuǎn)儀、PCR儀、電泳儀、冷凍離心機(jī)、氨基酸分析儀等。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)pH至 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基另加1.5%的瓊脂粉。)用于培養(yǎng)E.coliBL21(DE3)。培養(yǎng)溫度37 ℃。發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖10 g/L，甘油5 g/L，胰蛋白胨15 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO43 g/L，F(xiàn)eSO43 mmol/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.015 g/L)用于反式-4-羥脯氨酸發(fā)酵，用NaOH調(diào)節(jié) pH 至8.0，250 mL三角錐形瓶分裝30 mL。菌株E.coliBL21(DE3)ΔputA/pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，需要添加6～10 g/LL-脯氨酸；E.coliBL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp初步發(fā)酵添加1 g/LL-精氨酸。

抗生素的工作質(zhì)量濃度:氨芐青霉素50 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，氯霉素50 μg/mL。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表2，由上海生工合成。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物

注：下劃線部分是質(zhì)粒pKD4的抗性基因序列。

1.2 重組大腸桿菌的構(gòu)建

1.2.1 敲除基因argB獲得精氨酸缺陷型菌株

利用Red/ET同源重組系統(tǒng)[11-13]進(jìn)行基因敲除(圖2)。

H2, H1是同源臂;P1, P2是抗性基因序列圖2 利用Red/ET同源重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除的過程Fig.2 Processes of gene knockout using the plasmid-assistant Red homologous recombination

以輔助質(zhì)粒pKD4為模板，利用引物P1、P2通過PCR擴(kuò)增直接獲得含有目的基因上下游同源臂和kan基因的線性打靶片段；將表達(dá)Red重組酶的輔助質(zhì)粒pKD46導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)ΔputA感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，并制備為電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞(制備過程中需要添加L-阿拉伯糖以誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46的Exo蛋白、Beta蛋白和Gam蛋白的表達(dá))；將線性的打靶片段電轉(zhuǎn)導(dǎo)入電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)打靶片段與目的基因argB的配對(duì)重組(以kan基因片段替代目的基因argB)，之后采用42 ℃熱激耦合抗生素抗性負(fù)篩選的策略去除質(zhì)粒pKD46；通過菌落PCR對(duì)在卡那抗性平板上篩到的單菌落進(jìn)行驗(yàn)證；將表達(dá)FLP重組酶的輔助質(zhì)粒pCP20導(dǎo)入菌落PCR驗(yàn)證正確的陽性轉(zhuǎn)化子中，F(xiàn)LP重組酶可以直接作用于兩個(gè)FRT位點(diǎn)并發(fā)生同源重組，去除2個(gè)FRT位點(diǎn)之間的kan基因片段以消除卡那抗性，并留下一個(gè)FRT“疤痕”[14]。

1.2.2 大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備方法

挑取含有pkD46的E.coliBL21(DE3)ΔputA單菌落接種于氨芐抗性的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min過夜培養(yǎng)；取過夜種子液按1%接種量接種到50 mL 氨芐抗性的新LB培養(yǎng)基中，并加入4.8 g/L的L-阿拉伯糖，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.5～0.6；將培養(yǎng)液分裝于滅菌的50 mL離心管中，冰上預(yù)冷 10 min，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，回收細(xì)胞；加入等體積的冰預(yù)冷10%(v/v)甘油重懸，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，重復(fù)甘油洗2次；小心棄去上清，利用殘留的甘油重懸細(xì)胞，每管分裝80 μL，-80 ℃保存。

1.2.3 大腸桿菌化轉(zhuǎn)感受態(tài)制備方法

接種大腸桿菌單菌落于50 mL pH 7.0的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min過夜培養(yǎng)；取過夜種子液按1%接種量接種到pH 7.0的新鮮LB培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)(約2 h)至 OD600值達(dá)到0.5～0.6；將培養(yǎng)液分裝于滅菌的50 mL離心管中，冰上預(yù)冷 10 min；4 ℃，1 000×g 離心5 min，棄去上清，回收細(xì)胞；加入原培養(yǎng)液5%體積的TSB培養(yǎng)基充分懸浮菌體，緩慢吹打均勻；冰上放置10 min后分裝至已滅菌的1.5 mL離心管中，每管分裝50 μL，-80 ℃保存。

1.2.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法(熱擊法)[4]

轉(zhuǎn)化體系為：30 μL ddH2O，10 μL 5×KCM(5 mol/L KCl，0.15 mol/L CaCl2，0.25 mol/L MgCl2)，10 μL重組質(zhì)粒，10 μL感受態(tài)細(xì)胞。迅速混勻，先冰浴30 min；然后42 ℃熱擊90 s；接著冰浴5 min；最后加入600 μL新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h；取100 μL復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌液涂布于含抗生素的LB平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～16 h。

1.3 發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.1 搖瓶發(fā)酵

將重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)ΔputAΔargB/ pUC19-BH在含有氨芐霉素的LB平板上劃線培養(yǎng)；挑取單菌落接種于含有50 μg/mL 氨芐的LB液體培養(yǎng)基中(30 mL/250 mL三角瓶)，37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，作為種子液；按6%接種量取上述種子培養(yǎng)液1.8 mL接入發(fā)酵培養(yǎng)基(30 mL/250 mL三角瓶)，30 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 生物量的測(cè)定

取發(fā)酵液，用去離子水稀釋相應(yīng)倍數(shù)，并以去離子水為空白對(duì)照，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.3.3 葡萄糖的測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min 離心2 min，取200 μL上清液，加入200 μL DNS試劑，沸水浴5 min；用冷水冷卻樣品，然后加2.6 mL去離子水稀釋到3 mL，用分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.3.4L-脯氨酸的含量測(cè)定

L-脯氨酸的檢測(cè)采用酸性茚三酮顯色法：將發(fā)酵液離心后，取上清，適當(dāng)稀釋后取1 mL于10 mL試管中，加入1 mL冰乙酸；搖勻后加入1 mL酸性茚三酮；搖勻后沸水浴1 h；接著加入冰乙酸2 mL，搖勻后冷水冷卻，測(cè)定515 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.3.5 反式-4-羥脯氨酸積累量的測(cè)定

反式-4-羥脯氨酸的檢測(cè)采用氯胺T法：將發(fā)酵液離心后，取上清，稀釋后取2.5 mL于10 mL試管中，加入1 mL氯胺T，搖勻后室溫放置20 min；然后加入1 mL顯色劑，搖勻后迅速將試管置于60 ℃水浴鍋中，20 min后取出冷水冷卻，用分光光度計(jì)在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.3.6 反式-4-羥化酶酶活的測(cè)定[15]

全細(xì)胞酶活測(cè)定條件：測(cè)定發(fā)酵液的OD600，根據(jù)大腸桿菌OD600和細(xì)胞干重的常用轉(zhuǎn)換計(jì)算公式，根據(jù)DCW(g/L) =0.54×OD600測(cè)得細(xì)胞干重DCW。發(fā)酵液12 000 r/min離心2 min后，棄掉上清液，回收菌體，將500 μL的酶反應(yīng)緩沖液(MES 240 mmol/L(pH 6.5)，脯氨酸20 mmol/L，2-酮戊二酸40 mmol/L，硫酸亞鐵4 mmol/L，維生素C 8 mmol/L)加入到稱重好的菌體中，用酶反應(yīng)緩沖液將細(xì)胞重新懸浮后，在35 ℃搖床中，220 r/mim培養(yǎng)15 min后，轉(zhuǎn)移到100 ℃水浴中加熱2 min終止酶反應(yīng)，并測(cè)定反式-4-羥脯氨酸濃度，反式-4-羥脯氨酸的測(cè)定方法同上1.3.5。1個(gè)單位酶活定義1 min將1 nmol脯氨酸完全轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸的酶量，單位為U，全細(xì)胞酶活是每1 mg干菌體的酶活，單位為U/mg。

1.3.7 乙酰谷氨酸激酶活力測(cè)定[16]

2 mL反應(yīng)總體積中，含0.1 mL 酶液，0.1 mL 0.2 mol/L鹽酸羥胺，0.28 mL 0.14 mol N-乙酰谷氨酸，0.2 mL 0.02 mol MgCl2，0.14 mL 0.014 mol ATP，1.18 mL 0.1 mol Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，37 ℃水浴保溫30 min，加2 mL FeCl3試劑(3.4%FeCl3溶于2 mol/L HCl，并與8%三氯乙酸等體積混勻)終止反應(yīng)，測(cè)OD540值。1個(gè)酶活力單位(U)是指在上述條件下，反應(yīng)體系中每分鐘催化1 μmol N-乙酰谷氨酸氧化所需的酶量。

1.3.8 氨基酸的測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min 離心5 min 后，取上清500 μL，加入500 μL 10%磺基水楊酸沉淀4 h，用0.02 mol/L HCl稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用0. 22 μm微孔膜過濾后，采用氨基酸分析儀 L-8900測(cè)定氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1argB敲除菌株的驗(yàn)證

經(jīng)過抗性平板篩選，挑出只在非抗性平板上菌落，用驗(yàn)證引物Y1、Y2進(jìn)行菌落PCR，并進(jìn)行核酸膠驗(yàn)證。篩選到argB成功敲出的菌株。從圖3中可以看到出發(fā)菌株E.coliBL21(DE3)ΔputA菌落PCR得到片段大小為1 000 bp，與通過驗(yàn)證引物Y1、Y2進(jìn)行菌落PCR獲得的片段大小相當(dāng)(片段大小為964 bp)；卡那片段成功替換菌株菌落PCR得到片段大小為1 700 bp左右，與卡那基因片段大小相當(dāng)；消抗后從圖3可以看到除了菌株3-8，其余15株菌經(jīng)過菌落PCR得到大小為300 bp左右的片段，說明argB基因被成功敲除。由于利用Red/ET同源重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除會(huì)留下一個(gè)FRT“疤痕”，可能會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)造成影響，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該15株菌進(jìn)行了初步發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)菌株3-4脯氨酸產(chǎn)量高于其他菌株，且高于菌株BL21(DE3)ΔputA(圖4)，得到菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB。

M-5 000 bp DNA Ladder Marker；1-E. coliBL21(DE3) ΔputA的菌落PCR結(jié)果；2-E. coli BL21(DE3) ΔputA抗性替換成功菌株的菌落PCR結(jié)果；3-抗性消除菌株的菌落PCR結(jié)果圖3 argB基因敲除菌株的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of argB gene knockout strain

1代表菌株BL21(DE3)ΔputA的初步發(fā)酵結(jié)果；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16分別代表目標(biāo)菌株 3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-9、3-10、3-11、3-12、3-13、3-14、3-15、3-16的初步發(fā)酵結(jié)果圖4 argB基因敲除菌株的初步發(fā)酵Fig.4 The preliminary fermentation of argB gene knockout strain

2.2 重組菌株的構(gòu)建

通過材料與方法1.2.4中化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法，構(gòu)建菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH。通過使用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取重組菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH。質(zhì)粒進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證(圖5)。質(zhì)粒通過BamH I、KpnI進(jìn)行雙酶切，分別獲得基因片段hyp-Ptrp2-proB2A(BH片段，3416 bp)、載體pUC19(2 686 bp)，結(jié)果如泳道1；表達(dá)載體通過BamH I進(jìn)行單酶切，重組質(zhì)粒的大小約6 102 bp，結(jié)果如泳道2；從圖5可以看出這些片段的大小均與預(yù)期目標(biāo)相符，表明重組菌株構(gòu)建成功。

M1-5000bp DNA Ladder Marker；M2-5000bp DNA Ladder Marker；1-雙酶切結(jié)果；2-單酶切結(jié)果圖5 表達(dá)質(zhì)粒酶切電泳驗(yàn)證Fig.5 The electrophoresis test and verify of recombinant plasmid pUC19-BH by enzyme digestion

2.3 氨基酸分析儀檢測(cè)發(fā)酵液中氨基酸成分

通過氨基酸分析儀進(jìn)行初步定性分析結(jié)果(圖6)，可以發(fā)現(xiàn)菌株BL21(DE3)ΔputA/pUC19-BH與菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH發(fā)酵結(jié)果相比，前者精氨酸的含量明顯高于后者，精氨酸缺陷型菌株幾乎沒有精氨酸積累，這進(jìn)一步證明后者精氨酸途徑被成功切斷。同時(shí)，我們看到發(fā)酵液中有反式-4-羥脯氨酸生成，說明羥化酶得到表達(dá)，菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH構(gòu)建成功。

圖6 發(fā)酵液中各氨基酸分析結(jié)果Fig.6 The analytical results of amino acids in fermentation broth圖a-1，a-2：菌株BL21(DE3)ΔputA/pUC19-BH發(fā)酵液中氨基酸分析結(jié)果；圖b-1，b-2：無外源添加L-精氨酸時(shí)，菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH發(fā)酵液中氨基酸分析結(jié)果；圖c-1，c-2：外源添加適量L-精氨酸時(shí)，菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH與發(fā)酵液中氨基酸分析結(jié)果

2.4argB基因敲除菌株發(fā)酵參數(shù)

對(duì)敲除菌進(jìn)行初步發(fā)酵，并測(cè)定菌株的發(fā)酵參數(shù)，從結(jié)果(圖7)中，我們發(fā)現(xiàn)精氨酸缺陷型菌株無論是生長(zhǎng)狀況，葡萄糖消耗還是產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的能力均受到一定抑制。對(duì)于argB基因敲除菌株，該基因編碼的N-乙酰谷氨酸激酶的酶活幾乎為0 mU/mg，這更進(jìn)一步說明argB基因被成功敲除。另外，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中外源添加1 g/L的L-精氨酸時(shí)，菌體的生長(zhǎng)狀況得到了恢復(fù)，且反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比有所提高。因此，后文L-我們對(duì)精氨酸的添加量進(jìn)行了研究。

a-菌株BL21(DE3)ΔputA/pUC19-BH的發(fā)酵參數(shù)；b-無外源添加L-精氨酸時(shí)，菌株 BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH的發(fā)酵參數(shù)；c-外源添加1 g/L L-精氨酸時(shí)，菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH的發(fā)酵參數(shù)圖7 argB基因敲除菌株發(fā)酵結(jié)果Fig.7 The fermentationresults of argB knockout strains

2.5L-精氨酸對(duì)BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響

由于菌株是L-精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，所以種子培養(yǎng)基中需要加入適量的精氨酸來滿足菌體生長(zhǎng)的需求。本實(shí)驗(yàn)研究了精氨酸不同濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)。

argB基因的敲除，使得精氨酸合成受阻，菌株變?yōu)長(zhǎng)-精氨酸缺陷型菌株，因此外源添加精氨酸，可以補(bǔ)充菌體生命活動(dòng)所需的物質(zhì)。BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH菌體生長(zhǎng)能力的恢復(fù)，有利于反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的精氨酸，觀察菌體的生長(zhǎng)及反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量情況，結(jié)果如圖8所示。隨著精氨酸濃度的增加，菌株的生長(zhǎng)及反式-4-羥脯氨酸合成能力均有所提高。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的L-精氨酸濃度達(dá)到600 mg/L后，隨著精氨酸添加量的增加，反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量增長(zhǎng)趨勢(shì)變小。從生產(chǎn)成本考慮，選擇在培養(yǎng)基中添加600 mg/L的L-精氨酸，此時(shí)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到 312.67 mg/L，較出發(fā)菌株BL21(DE3)ΔputA/pUC19-BH產(chǎn)量233.59 mg/L提高了25.29% ；細(xì)胞生長(zhǎng)量也恢復(fù)到了親本水平。由此可見，精氨酸的添加有利于菌株的生長(zhǎng)及反式-4-羥脯氨酸的積累。

圖8 L-精氨酸添加量的優(yōu)化Fig.8 The optimization of addition amount of L-arginine

3 討論

本研究通過Red/ET同源重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除，成功構(gòu)建了argB基因敲除菌株 BL21(DE3)ΔputAΔargB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組菌株的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量有所提高。說明argB基因的敲除有利于反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)。

argB基因編碼精氨酸合成途徑的乙酰谷氨酸激酶。敲除argB基因后，胞內(nèi)精氨酸合成受阻，可能使更多前體谷氨酸流向L-脯氨酸合成途徑，從而提高作為反式-4-羥脯氨酸底物的L-脯氨酸產(chǎn)量。但L-精氨酸是必須氨基酸，對(duì)維持菌體正常生命活動(dòng)有重要意義，所以其敲除影響了菌體的生長(zhǎng)。我們對(duì)L-精氨酸的添加量進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適量的精氨酸添加可以使得敲除菌株恢復(fù)生長(zhǎng)性狀，同時(shí)反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到312.67 mg/L與實(shí)驗(yàn)室原有水平相比有了顯著的提高。

該生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法與原生產(chǎn)方法相比，原生產(chǎn)法方在搖瓶發(fā)酵時(shí)需要添加6～10 g/L的L-脯氨酸作為底物，而該生產(chǎn)方法只需添加0.6～1 g/L的L-精氨酸來滿足菌體生長(zhǎng)；且L-脯氨酸的價(jià)格高于L-精氨酸。因此本文所構(gòu)建的菌株在生產(chǎn)過程中展現(xiàn)出成本低，發(fā)酵過程易控制，發(fā)酵水平穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，這為反式-4-羥脯氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好基礎(chǔ)。

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Fermentative production oftrans-4-hydroxyproline with arginine-deficient strain

WANG Xiao-jiao,ZHANG Zhen-yu*,SUN Fu-bao*,YU Lin

(College of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to obtain high-yield strains oftrans-4-hydroxyproline, based on the guidance ofE.colimetabolic network model and usingE.coliBL21 (DE3)ΔputAas the original strain, geneargBwas knocked out successfully, which blocked metabolic pathways branch ofL-glutamic acid,L-proline synthetic precursors and increased synthesis ofL-proline metabolic flux. The constructed arginine-deficient strainE.coliBL21 (DE3)ΔputAΔargBwas transformed with the expression plasmid pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp. The expression plasmid contains the mutant geneproB2encoding glutamate kinase that significantly reducedL-proline feedback inhibition. Fermentation results indicated thatthetrans-4-hydroxyproline production of recombinant strain reached 312.67 mg/L after addition of 600 mg/L exogenous arginine, which increased by 25.29% compared withE.coliBL21(DE3)ΔputA/ pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp.

Escherichiacoli;trans-4-hydroxyproline; knockout; proline

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701005

碩士研究生(張震宇教授,孫付保副教授為通訊作者,E-mail:zhangzy@gmail.com;fubaosun@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(30970058)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012554)；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))開放課題基金(KLIB-ZR200801)

2016-07-18，改回日期：2016-09-09