徐獻群 王 陳 吳業(yè)勤 黃朱亮 嚴 明

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新發(fā)現(xiàn)Leber先天性黑矇患者復合雜合突變位點c.1831T>C/c.2172T>A

徐獻群1王 陳1吳業(yè)勤1黃朱亮1嚴 明2，*

目的：報告一例散發(fā)Leber先天性黑矇(LCA)家系的致病基因復合雜合突變位點c.1831T>C/c.2172T>A。方法：收集LCA患兒臨床和家系資料，采集該家系成員患兒及其父母外周靜脈血，提取基因組DNA，先行目標區(qū)域捕獲測序篩查已知的眼科遺傳病相關基因，再利用生物信息學分析獲取候選基因，最后經Sanger法測序驗證及對突變位點進行分子生物信息學分析。結果：高通量測序篩查結果證實患兒CRBI基因上存在復合雜合突變(c.1831T>C，p.S611P；c.2172T>A，p.Y724X)。c.2172T>A為無義突變，具有明顯的致病性。Anthe_2000軟件分析p.S611P突變未引起蛋白二級結構和疏水性明顯變化。結論：CRBI基因的復合雜合突變(c.1831T>C,c.2172T>A)可能導致LCA8型的發(fā)生。

Leber先天性黑矇；CRBI基因復合雜合突變

Leber先天性黑矇(Leber Congenital Amaurosis, LCA)由德國眼科醫(yī)生Theodor Leber 于1869年首先報道[1]，是發(fā)生最早、最嚴重的遺傳性視網膜病變，也是1歲以內嬰幼兒致盲的主要原因，占遺傳性視網膜疾病的5%以上，占盲校兒童致盲原因的20%[2]。其臨床特征為固視障礙、畏光、眼球震顫、指壓眼球。早期眼底多正常，晚期可出現(xiàn)脈絡膜萎縮、視網膜血管狹窄、骨細胞樣色素和椒鹽樣色素沉著等。

LCA具有高度異質性及表型多樣性，多呈常染色體隱性遺傳。分子生物學研究業(yè)已證實LCA的發(fā)生涉及不同功能通路的至少22個基因，這些基因的突變占所有LCA病因的75%左右[3]。而更廣泛、深入的探討研究，包括找尋新的突變位點的工作仍在不斷進行之中。本文作者采用目標區(qū)域捕獲測序技術對一例散發(fā)LCA家系進行致病基因篩查過程中發(fā)現(xiàn)先證者存在復合雜合突變位點c.1831T>C/c.2172T>A，且在此之前未見報道，遂于首次報道。

1 資料與方法

1.1 臨床病例

患兒，女，1歲，門診時發(fā)現(xiàn)患有斜視、畏光，視力不正常、怕暗，色盲本可部分識別，喜用手指觸壓眼球，不能固視和追視，疑診為LCA。光學相干斷層掃描示整個視網膜變薄。采用眼部廣域數(shù)字成像系統(tǒng)(RetCamⅢ)眼底檢查示雙眼黃斑區(qū)地圖樣萎縮灶，視網膜血管普遍變細、扭曲，視網膜從后極到周邊部呈現(xiàn)廣泛的椒鹽樣色素沉著(圖1)。視網膜電圖表現(xiàn)為a、b波平坦，甚至消失。

1.2 家系分析

患兒父母非近親結婚，無LCA臨床表現(xiàn)，家系圖譜見圖2。

注：□為正常男性，○為正常女性，●為女性患者；

1.3 遺傳分子學檢測方法

采集該家系LCA先證者及其父母肘靜脈血，采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)按照常規(guī)操作提取DNA備檢。

1.3.1 目標區(qū)域捕獲測序：將先證者基因組DNA用Covaris S2(美國Massachusetts公司)打斷，制備200-300bp的基因組雙末端文庫；用定制化捕獲芯片(美國Agilent SureSelect公司)捕獲眼科遺傳病相關基因的外顯子及相鄰內含子區(qū)域(50bp)；然后將文庫在芯片上富集和雜交72h[4]；雜交完成后，將芯片按標準流程洗脫；最后將捕獲到的文庫通過Illumina HiSeq2000 Analyzers(美國Illumina公司)進行測序。按照產品標準測序流程，每個read 90個循環(huán)產生雙末端reads。堿基識別和圖像分析由Illumina Pipeline(美國Illumina公司)執(zhí)行并產生原始數(shù)據(jù)。測序數(shù)據(jù)運用NextGene V2.3.4軟件(美國SoftGenetics公司)與UCSC數(shù)據(jù)庫(美國California Santa Cruz大學)提供的人類基因組(hg19)參考序列進行比對。

1.3.2 生物信息學分析：所有的單核苷酸變異、插入和缺失都經過NCBI SNP數(shù)據(jù)庫、人類基因組單體型圖計劃數(shù)據(jù)庫、1000人基因組計劃數(shù)據(jù)庫篩選。對以上測序發(fā)現(xiàn)的可疑致病性突變與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)比對，判斷是否為已知突變。同時運用錯義在線預測軟件PolyPhen-2和Mutation Taster分析突變對蛋白質功能的影響。并采用同源序列多重比對，分析突變位點在不同物種間的保守性。再利用Anthe_2000軟件(法國Biology and Chemistry of Proteins研究院)進行蛋白二級結構和疏水性分析。

1.3.3 Sanger法測序驗證：將經過測序和信息學分析篩選的候選突變基因采用PCR和Sanger測序驗證。PCR引物用Primer 5.0軟件設計，擴增產物用Bigdye terminator循環(huán)測序試劑盒(ABI, Foster City, CA, USA)測序，采用ABI 3130型遺傳分析儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)進行分析。同時將候選基因突變在先證者父母中驗證，判斷突變的來源。

2 結 果

2.1 目標區(qū)域捕獲測序

對已知的365個眼科遺傳病相關基因的目標區(qū)域捕獲測序，并采用多個數(shù)據(jù)庫進行綜合分析。經過與hg19比對，共發(fā)現(xiàn)變異3 578個，過濾掉不影響氨基酸改變的位點后剩下311個，再過濾掉頻率>0.01的位點后，只剩下4個變異：ASB10[5]雜合的插入突變(c.1238_1239insA)、POMT1[6]的雜合錯義突變(c.1303A>G)和CRBI的復合雜合錯義突變(c.1831T>C, p.S611P；c.2172T>A, p.Y724X)。前兩個基因的變異為隱形遺傳病雜合突變，與受檢者臨床表型無明確關聯(lián)，勿需繼續(xù)驗證分析。而CRBI的復合雜合無義突變(c.1831T>C, c.2172T>A)是否為致病突變基因，需進一步論證。

2.2 分子生物信息學分析

c.2172T>A無義突變已被證實具有明顯致病性[7]。p.S611位點在不同物種中高度保守(表1)，c.1831T>C錯義突變可能對蛋白結構影響較大；p.S611P PolyPhen2預測突變分值為0.925(分值越接近1，突變造成損害的可能性越大)，很可能對蛋白質功能造成損害；Mutation Taster也顯示該位點為致病突變。Anthe_2000軟件分析顯示p.S611P位點對蛋白二級結構和疏水性未發(fā)現(xiàn)明顯影響。

2.3 Sanger法測序驗證

Sanger測序發(fā)現(xiàn)，先證者母親(Ⅰ2)攜帶CRBI基因c.1831T>C(p.S611P)雜合突變，先證者父親(Ⅰ1)攜帶c.2172T>A(p.Y724X)雜合突變(圖3)。參考有關文獻[8]，先證者(Ⅱ2)存在CRBI的復合雜合錯義突變(c.1831T>C, c.2172T>A)即可診斷為LCA8型。

表1 不同物種c.1831T>C突變位點同源序列比對

[本文圖1、圖3見封3]

3 討 論

LCA是一種嚴重的先天性致盲性視網膜營養(yǎng)不良疾病。已知一些綜合征和非綜合征視網膜疾病致病基因(ALMS1、BBS4、CNGA3、IQCB1、KCNJ13和MYO7A)突變與LCA或LCA樣表型相關[9-14]，而另一方面，至少有7種LCA致病基因與青少年視網膜色素變性有關[9, 15]。這種現(xiàn)象表明許多視網膜疾病可能具有相似的致病機制，但相同的視網膜疾病有不同的致病基因。LCA的致病基因還與其它視網膜營養(yǎng)不良的臨床特征相關，例如錐桿細胞營養(yǎng)不良(CRX[16]和AIPL1[17])以及Joubert和Meckel綜合征(CEP290[18, 19])。因此，LCA具有高度異質性和表型多樣性，僅憑臨床表型進行診斷和準確分型十分困難，精確的分子診斷對LCA極為重要。

LCA呈常染色體隱性遺傳，也有少數(shù)為常染色體顯性遺傳，目前已知至少有22個基因的突變會引起LCA。2014年Wang等[3]對中國145個LCA家系進行了突變譜分析，發(fā)現(xiàn)有107個家系為純合突變或者復合雜合突變，其中CRBI基因突變頻率最高。CRBI基因定位于染色體1q31.3，僅在視網膜和腦組織中表達，編碼一種和果蠅屑蛋白相似的蛋白，該蛋白定位在哺乳動物感光細胞內部，是控制眼睛極性發(fā)育的分子支架的成分。CRBI基因突變沒有明顯的突變熱點區(qū)域，分散在整個基因中，該基因突變使感光細胞異常，導致視網膜營養(yǎng)不良，引起LCA。本文在先證者中發(fā)現(xiàn)的CRBI基因c.1831T>C(p.S611P)和c.2172T>A(p.Y724X)雜合突變，均為HGMD數(shù)據(jù)庫報道的已知致病性突變，但在一個LCA患者發(fā)現(xiàn)c.1831T>C和c.2172T>A復合雜合突變是第一次。母親攜帶CRBI基因c.1831T>C(p.S611P)雜合突變，父親攜帶c.2172T>A(p.Y724X)雜合突變。此遺傳方式符合常染色體隱性遺傳疾病的遺傳特點。PolyPhen2和Mutation Taster預測均表明c.1831T>C為致病突變，同源序列多重比對分析顯示該突變位點在不同物種間高度保守，可能對蛋白結構影響較大。然而運用Anthe_2000軟件對p.S611P位點進行蛋白二級結構和疏水性分析發(fā)現(xiàn)沒有明顯的變化，表明該位點的突變不影響蛋白質的二級結構和疏水性，可能對蛋白質的三級結構有影響，有待后續(xù)研究論證。

傳統(tǒng)的Sanger法測序是對每個外顯子進行直接測序，具有簡便、準確、讀長高等優(yōu)點。但是LCA致病基因眾多，外顯子數(shù)量龐大，這使得直接測序成本高，工作量大。第二代測序技術不需要進行DNA模板克隆，而是使用接頭進行高通量的并行PCR和并行測序反應，使測序的通量持續(xù)增長，大大促進了基因組分析技術的發(fā)展。其中全外顯子測序技術更是尋找孟德爾遺傳病致病基因的一種有效方法[20]。雖然外顯子序列僅占人類全基因組序列的1%，但85%與人類疾病相關的基因突變都位于這些編碼序列和剪切位點。因此，相比于更加繁瑣的全基因組測序，這一方法能極大地提高發(fā)現(xiàn)致病基因的效率[20]。本研究采用的目標區(qū)域捕獲測序技術，與Sanger測序相比，具有高效、準確、價廉的優(yōu)勢，能對LCA這類致病基因高度異質性的眼科遺傳病進行快速、有效、精確的基因診斷[21-25]。但該技術中目標基因只針對已知的與疾病相關的基因，一些尚未明確的基因不在檢測范圍內，這也是該方法的局限所在。為保證數(shù)據(jù)分析的精確性，本方法的平均測序深度為122.54×,目標區(qū)域內覆蓋度過低的變異將被濾掉。該方法可以發(fā)現(xiàn)小片段缺失/插入變異，但更大的缺失/重復難以準確檢測；另外基因調控區(qū)及深度內含子區(qū)可能存在的致病性變異無法檢測。

目前，LCA尚無根治方法。眼睛作為一個相對獨立的中樞神經系統(tǒng)的附屬器官，同時視網膜下腔具有免疫赦免的特點，為基因治療提供比較安全的空間。2008年，Maguire等[26]在LCA患者視網膜下腔注射包含RPE65互補DNA(cDNA)的重組病毒伴隨病毒(AAV)載體，使RPE65互補DNA(cDNA)在人視網膜RPE65基因啟動子控制下得到表達，產生感光色素，從而取代喪失功能的色素，使患者的視力得到了不同程度的提高。近期有研究表明，患者的視網膜變性在持續(xù)進展，這種基因治療后視力的提高有可能只是短期的[27]，其遠期療效還需要大量的臨床試驗去評估[28]。

綜上所述，目標區(qū)域捕獲測序技術為臨床表現(xiàn)多樣、致病基因眾多的LCA基因變異的檢測提供了新的技術手段。本研究在我國一例散發(fā)LCA患者中發(fā)現(xiàn)了CRBI基因的復合雜合突變(c.1831T>C, c.2172T>A)，這種復合雜合突變的組合此前未見報道。這為研究CRBI基因對人類眼部發(fā)育的作用以及LCA的發(fā)病機制提供了新的線索，也對LCA的產前診斷、遺傳咨詢以及基因治療有一定的意義。

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本文第一作者簡介：

徐獻群(1970-)，女，漢族，碩士，主管技師，主要從事遺傳病的基因診斷

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Two Compound Heterozygous Variants(c. 1831T>C/c. 2172T>A) in Leber Congenital Amaurosis

XU Xian-qun1， WANG Chen1， WU Ye-qin1， HUANG Zhu-liang1， YAN Ming2，*

1Department of Clinical Gene Diagnosis Center;2Department of Ophthaimology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China；*Corresponding author

Objective: To report two compound heterozygous variants(c.1831T>C/c.2172T>A) in a sporadic family with Leber congenital amaurosis (LCA).Method: The clinical information and family data of a LAC patient was collected. Genomic DNA was extracted from the blood samples of all family members. We developed a panel for targeted exome sequencing of the patient by selecting related genes of inherited retinal disease. Further bioinformatics analyses and Sanger sequencing were done to confirm the candidate variants. In silico analyses, including PolyPhen-2, Mutation Taster, multiple sequence alignment and protein molecular secondary structures and hydrophobicity were performed to predict the consequences of each variant identified. Results: After targeted exome sequencing and comprehensive analysis, two compound heterozygous variants (c.1831T>C, p.S611P;c.2172T>A, p.Y724X) were identified in the CRBI gene which was responsible for causing LCA. The later was a nonsense mutation that was disease-causing obviously. Protein molecular secondary structures and hydrophobicity analysis by Anthe_2000 p.S611P didn't show significant change.Conclusion: In this study, two compound heterozygous variants (c.1831T>C/c.2172T>A) in CRBI that are likely to be the disease-causing variants of LCA 8.

Leber congenital amaurosis (LCA)； CRBI gene compound heterozygous variants

武漢大學中南醫(yī)院，武漢 430071；1臨床基因診斷中心；2眼科；*

本文2016-07-18收到，2016-09-29修回

Q319+.31

A

1005-1740(2016)04-0015-05