劉春來 李永文 董云龍 張洪兵 李穎 劉紅雨 陳軍

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，總的5年生存率僅10%左右[1-3]?，F在的研究[4-10]表明，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、KRAS（kirsten rat sarcoma viral oncogene,K-ras）、人類棘皮動物微管相關蛋白樣4（echinoderm microtubule-associated- protein-like 4,EML4）和人類間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）重排形成的融合基因EML4-ALK等基因是肺癌發(fā)生發(fā)展的驅動基因（driver gene），應用針對這些驅動基因及信號通路的藥物進行分子靶向治療，在取得明顯療效的同時又避免對正常細胞傷害，顯示了誘人的治療前景。EML4-ALK融合基因2007年由日本學者發(fā)現，定位于2號染色體的短臂上（2p21和2p23）[5]。在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）人群中EML4-ALK陽性率約為3%-7%左右，但在女性、無或僅少量吸煙史的肺腺癌患者中EML4-ALK融合基因陽性率高達15%[11]。

動物實驗提示EML4-ALK融合基因具有潛在致瘤性，是肺癌發(fā)生的驅動基因，但其致瘤機制尚未闡明。EML4-ALK融合基因陽性患者對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）原發(fā)性耐藥，而可能對ALK抑制劑有效[12,13]。2011年8月美國食品藥品管理局批準ALK抑制劑克唑替尼用于局部晚期或轉移性ALK陽性NSCLC的一線治療，對于ALK陽性的NSCLC患者，克唑替尼顯示出了一定的治療活性，并可延長患者的生存期，其無進展生存期為9.7個月，但是，克唑替尼與EGFR-TKI一樣，使用一段時間后會產生獲得性耐藥，而揭示EML4-ALK的致瘤機理對EML4-ALK患者的治療及克服耐藥將產生重要作用[6,9]。

細胞因子信號轉導抑制因子（suppressor of cytokine signaling, SOCS）是一類在細胞信號轉導過程中起重要作用的負調控因子，主要通過抑制JAK-STAT（janus protein tyrosine kinase, signal transducers and activators of transcription）等信號通路的持續(xù)激活來調控細胞的增殖、分化和凋亡[14-16]。由于JAK-STAT信號通路是多種腫瘤驅動基因重要下游信號通路，近年來的研究發(fā)現，SOCS啟動子區(qū)異常甲基化在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，包括肝癌、胃癌、肺癌和血液系統(tǒng)腫瘤等，但是在EML4-ALK融合基因陽性肺癌中的情況卻未見報道[17-21]。本研究的目的在于探討人類EML4-ALK融合基因陽性肺癌組織和細胞中SOCS3啟動子異常甲基化情況，為進一步闡明SOCS3在EML4-ALK陽性肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要儀器 人NSCLC細胞株H2228細胞，A549細胞購于ATCC、人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞、人胚胎腎上皮細胞HEK293細胞由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津市肺癌研究所保存；7例ALK陽性患者來自于天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺部腫瘤外科的手術病例。RMPI1640和DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及Trizol試劑購自Life Technologies公司（Carlsbad, CA, USA）；實時熒光定量PCR試劑盒、Premix Ex TaqHotstart Version購自Takara公司（Dalian, China）；反轉錄試劑盒購自Promega公司（Madison, WI, USA）；QIAampDNA Mini Kit和EpiTect Bisulfite Kit購自Qiagen公司（Hilden, Germany）；甲基轉移酶抑制劑5’-氮雜-2’-脫氧胞苷（5’-Aza-dC）購自Sigma-Aldrich公司（Kansas, Missouri, USA）。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理 除HEK293細胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)，其他細胞均培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，0.25%胰酶-EDTA（ethylenediamine tetracetic acid）消化傳代，所有實驗均采用對數生長期細胞。5’-Aza-dC溶于二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）溶液中，10 μmoL/L處理6孔板中細胞（每孔2×105細胞），每個濃度3個孔，處理72 h。

1.3 組織及細胞DNA提取 細胞及組織按QIAamp DNA Mini Kit說明書步驟進行DNA提取，DNA提取后瓊脂糖電泳檢測DNA純度，并用紫外分光光度計進行定量。

1.4 甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR, MSP）

1.4.1 基因組DNA亞硫酸鹽修飾分別取800 ng DNA按照EpiTect Bisulfite Kit（QINGEN）的說明書進行亞硫酸鹽處理，反應在PCR儀上進行，處理條件：99 ℃、5 min，60 ℃、25 min，99 ℃、5 min，60 ℃、85 min，99℃、5 min，60 ℃、175 min，最后置20 ℃不超過24 h。純化回收的DNA -20 ℃保存?zhèn)溆?，用于甲基化特異PCR分析。

1.4.2 MSP-PCR擴增和產物的凝膠純化取20 ng DNA為模板進行啟動子目的片段的擴增。采用巢式PCR法，第一輪PCR引物序列為： SOCS3-F 5'-GATTYGAGGGGGTTTAG TTTTAAGGA-3'，SOCS3-R 5'-CCACTACCCCAAAAACCC TCTCCTAA-3'，反應條件為：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，設置降落PCR，每個循環(huán)降落0.5 ℃，14個循環(huán)；再加20個循環(huán)的95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、30 s。第二輪PCR取1 μL第一輪PCR產物為模板進行擴增，甲基化引物序列為：M-F 5'-GGAGATTTTAGGTTTTCGGAATATTTC-3'，M-R 5'-CCCCCGAAACTACCTAA ACGCCG-3'，非甲基化引物序列為U-F 5'-GTTGGAGATTT TAGGTTTTTGGAATATTTT-3'，U-R 5'-AAACCCCCAAAA CTACCTAAACACCA-3'，反應條件：95 ℃、5 min，95℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30個循環(huán)；72 ℃、5 min，4 ℃保存。擴增產物經2%瓊脂糖電泳進行鑒定，并設以雙蒸水為模板的陰性對照。

1.4.3 亞硫酸鹽測序上述PCR產物經回收純化后，交由北京華大基因公司測序，根據甲基化位點的個數計算分析SOCS3基因啟動子甲基化水平。

1.5 Real-time PCR Trizol法常規(guī)提取5'-Aza-dC處理細胞總RNA，紫外分光光度儀定量，以Reverse Transcriptase Kit（Promega）將2 μg RNA反轉成cDNA。20 ng cDNA為模板，與ABI SYBR Green Master Mix （ABI）及相應引物混合，置于實時熒光定量PCR儀Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System instrument and software（Applied Biosystems, USA）進行Real-time PCR反應。反應條件：95 ℃、20 s；40個PCR循環(huán)（95 ℃、10 s；60 ℃、20 s；72 ℃、10 s）。以PGK作為內參照，未處理樣本作為矯正因子，數據采用2-ΔΔCT法進行分析，ΔCT=CT-CT（PGK），ΔΔCT=ΔCT（24 h、48 h、72 h）-ΔCT（0 h）（H2228、A549、H460、B2B）[22]。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot） RIPA裂解收集細胞蛋白溶液，BCA法測濃度，與5×SDS-PAGE蛋白緩沖液充分混勻，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性后，取30 μg蛋白上樣量上樣，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，100 V轉膜65 min、5%脫脂牛奶的1×TBST中室溫封閉1 h，加入鼠抗人SOCS3單克隆抗體，1：500稀釋，4 ℃孵育過夜。加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，顯色曝光[23]。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，同一細胞系兩組間比較采用兩樣本均數t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SOC3啟動子區(qū)CpG島的查找及MSP引物設計 應用USUC數據庫預測人SOCS3 DNA啟動子序列并獲取啟動子上游2,000 bp，再通過MethPrimer在線分析網站和Methyl Primer Expressv 1.0軟件分析這段序列的CPG島，采用標準：堿基對＞300，GC＞50%，觀察值/預測值＞0.6。結果顯示SOCS3啟動子的CpG島長度545 bp，位于871 bp-1,415 bp。通過Methyl Primer Expressv 1.0軟件設計出PCR引物。

2.2 MSP法檢測細胞和肺癌腫瘤組織中SOCS3啟動子甲基化狀態(tài) 提取7例EML4-ALK陽性肺癌患者腫瘤組織和EML4-ALK陽性腫瘤細胞H2228、EML4-ALK陰性腫瘤細胞A549、HEK-293細胞、人胎盤細胞的DNA，應用重亞硫酸鹽處理，未甲基化的胞嘧啶（C）將轉變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶（C）不變。將上述經重亞硫酸鹽處理后的DNA用MSP引物擴增，來檢測SOCS3啟動子區(qū)的甲基化情況。圖1所示MSP結果顯示H2228細胞、A549細胞、HEK-293細胞、H460細胞和7例腫瘤組織中的3例SOCS3啟動子區(qū)存在不同程度的甲基化，BEAS-2B細胞及人胎盤組織細胞中不存在SOCS3啟動子區(qū)的甲基化情況。PCR產物經DNA測序分析，證實SOCS3啟動子區(qū)存在DNA甲基化（圖2）。

2.3 甲基轉移酶抑制劑5’-Aza-dC處理，上調SOCS3表達為了進一步探討DNA甲基化對SOCS3表達的調控情況，我們用甲基轉移酶抑制劑5’-氮雜-2’-脫氧胞苷（5’-AzadC）處理上述細胞。以10 μm/孔連續(xù)處理不同的細胞72 h后分別提取RNA和蛋白，用Real-time PCR及Western blot檢測SOCS3表達水平的變化情況，以DMSO處理組作為對照組。結果顯示，與對照組相比，A549細胞和H2228細胞中SOCS3的表達水平有明顯提高，分別提高了4.97倍（P＜0.05）和3.66（P＜0.05）倍。而在BEAS-2B細胞和H460細胞中SOCS3的表達則變化不明顯甚至表現為降低（圖3）。進一步通過Western blot來驗證去甲基化處理后SOCS3表達水平的變化，結果與Real-time PCR結果一致（圖4）。

3 討論

SOCS3是經典的JAK-STAT信號通路負反饋調節(jié)蛋白之一，其可以通過抑制STAT的磷酸化及其二聚體的形成或者直接抑制JAK的磷酸化來負向調節(jié)JAK-STAT通路，從而抑制細胞的持續(xù)增殖和分化[14,16,24,25]。SOCS功能異常導致其對JAK-STAT通路的抑制作用隨之消失，而啟動子異常甲基化是SOCS3功能異常的重要機制。

SOCS家族分子的超甲基化在多種腫瘤中被發(fā)現，如肺癌、肝癌、前列腺癌、食管癌等[26-29]。比如，日本的學者用實時定量PCR和免疫印跡的方法發(fā)現肝癌組織中SOCS3的表達低于正常肝組織，并且通過特異性敲除小鼠SOCS3基因，使得SOCS3對STAT3的抑制作用消失導致STAT3持續(xù)活化，其抗細胞凋亡的作用隨之增強，致癌物誘導肝癌發(fā)生的作用也隨之增加，證明了超甲基化導致的SOCS3表達缺失與肝癌的發(fā)生有關[20]。

我們的研究證實在EML4-ALK陽性細胞H2228及部分EML4-ALK陽性患者腫瘤組織中存在SOCS3基因的異常甲基化，轉甲基化酶抑制劑5’-Aza-dC處理能在mRNA水平和蛋白水平增加SOCS3的表達，MSP及基因測序分析進一步證實這些細胞中存在異常甲基化修飾。因此，在上述肺癌細胞中SOCS3的表達受異常甲基化調控。

由于SOCS蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，現在已經有學者嘗試將SOCS家族蛋白激活劑用于臨床前研究，并取得了一定的進展，比如，有研究[15,18,30,31]指出腫瘤的治療中激活SOCS后再用JAK抑制劑的效果比單用JAK激酶抑制劑的效果要好；Kim等[30,32,33]學者發(fā)現恢復SOCS1和SOCS3的表達能夠增加宮頸癌細胞對放療的敏感性；在NSCLC中也發(fā)現恢復SOCS3的表達不僅能夠促進腫瘤細胞的凋亡，而且還能增加其對放療的敏感性。因此提示針對SOCS的靶向治療的研究，將會為腫瘤靶向治療提供新的思路。

圖1 MSP方法檢測肺癌細胞株及EML4-ALK陽性肺癌樣品中SOCS3基因啟動子甲基化狀態(tài)。M：甲基化特異；U：非甲基化特異Fig 1 MSP assay for SOCS3 promoter in different lung cancer cell lines and EML4-ALK (+) lung cancer tissues.M：methylated-specific; U:unmethylated-specific.

圖2 H2228細胞SOCS3啟動子MSP分析后測序驗證Fig 2 The MSP result of SOCS3 promotor were verified by DNA sequencing in H2228 cells

圖3 Real-time PCR檢測5'-Aza-dC處理不同肺癌細胞后，SOCS3表達水平的變化情況。*P＜0.05Fig 3 The analysis of SOCS3 expression by Realtime PCR in human lung cancer cell lines after 5'-Aza-dC treatment.*P＜0.05

圖4 Western blot檢測肺癌細胞株經5'-Aza-dC處理后SOCS3表達水平的變化Fig 4 The analysis of SOCS3 expression by Western blot in human lung cancer cell lines after 5'-Aza-dC treatment