王駿瀅 薛虛慧 張曉東 孫元明

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所；天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

谷胱甘肽保護(hù)的金納米團(tuán)簇對HeLa細(xì)胞毒性研究

王駿瀅 薛虛慧 張曉東 孫元明

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所；天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 探究由谷胱甘肽作為表面保護(hù)劑的金納米團(tuán)簇（GSH-Au NCs）對宮頸癌HeLa細(xì)胞株的毒性影響。方法 利用熒光分光光度計(jì)測定用含有GSH-Au NCs的培養(yǎng)基處理HeLa細(xì)胞后不同時間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，觀察HeLa細(xì)胞對GSH-Au NCs在1、2、6、12、24 h內(nèi)的攝取情況。同時采用BALB/c荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分別腹腔注射0.2 ml濃度為3 mmol/L的GSH-Au NCs和等體積的蒸餾水（對照組）后24 h取出腫瘤組織，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）檢測組織中的金元素含量以探究納米團(tuán)簇在腫瘤處隨時間的攝取情況。最后用噻唑藍(lán)（MTT）比色法研究不同濃度（0.003～0.3 mmol/L）的GSH-Au NCs處理HeLa細(xì)胞24、48 h的細(xì)胞毒性。結(jié)果 HeLa細(xì)胞對GSH-Au NCs的攝取率在24 h內(nèi)不斷升高，24 h時達(dá)峰值73.13%。荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)表明，腹腔注射GSH-Au NCs 24 h后，腫瘤組織對GSH-Au NCs的攝取量（320±15）ng/g較對照組（腹腔注射蒸餾水）高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。用不同濃度的GSH-Au NCs處理HeLa細(xì)胞24 h，對細(xì)胞存活率有輕微影響，隨濃度升高對細(xì)胞的抑制作用更為明顯，GSH-Au NCs濃度為0.3 mmol/L時的HeLa細(xì)胞存活率降為對照組（GSH-Au NCs濃度為0）的86%（P＜0.05）；處理48 h時，各濃度組的細(xì)胞存活率與對照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論 雖然 GSH-Au NCs在體外和體內(nèi)均易被細(xì)胞和腫瘤組織攝取，但其本身對HeLa細(xì)胞并無明顯細(xì)胞毒性，可安全應(yīng)用于影像、載藥及靶向給藥等生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

谷胱甘肽保護(hù)的金納米團(tuán)簇； 細(xì)胞毒性； HeLa細(xì)胞

0 引言

金納米團(tuán)簇（Au nanoclusters,Au NCs）是一類尺寸易調(diào)控、水溶性好的無機(jī)小分子納米材料，表面易修飾載藥，具有良好的熒光特性，能實(shí)現(xiàn)高效腎清除[1-3],近年來在腫瘤相關(guān)的生物成像、放射增敏等領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注。腫瘤組織對谷光甘肽保護(hù)的金納米團(tuán)簇（glutathione protected Au nanoclusters, GSH-Au NCs）的攝取能力主要取決于后者的尺寸與結(jié)構(gòu)，親水半徑＜5 nm的GSH-Au NCs能大部分（90%以上）通過腎臟排出。此外，尺寸較小的納米團(tuán)簇對腫瘤的靶向作用更好，這是由于腫瘤組織內(nèi)血管基質(zhì)不完善且血管系統(tǒng)豐富，血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較正常組織更寬，使得小分子納米團(tuán)簇被動進(jìn)入腫瘤；同時腫瘤組織內(nèi)淋巴回流缺陷，使得進(jìn)入的GSH-Au NCs不易被排出，稱為增強(qiáng)滲透和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention,EPR）[4]。通常GSH-Au NCs進(jìn)入生物內(nèi)環(huán)境后，會與血漿中的多種蛋白相互作用并吸附至其表面，在調(diào)理作用下被巨噬細(xì)胞識別捕獲；同時粒徑增大也使得GSH-Au NCs更易進(jìn)入肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，長期積累易產(chǎn)生病灶。因此，對GSH-Au NCs表面進(jìn)行修飾能有效延長其血液循環(huán)時間從而持續(xù)在腫瘤組織積累。GSH是廣泛存在于生物體內(nèi)的小分子多肽，對機(jī)體免疫和解毒有積極作用。將GSH-Au NCs通過Au—S共價(jià)鍵結(jié)合，包埋于GSH內(nèi)能有效幫助其減少蛋白吸附并躲避肝脾攝取，同時暴露于表面的羧基與氨基使得GSH-Au NCs便于修飾載藥?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，GSH-Au NCs是納米材料中最具優(yōu)勢的放射增敏劑和載藥材料之一。研究表明，GSH-Au10在腫瘤部位24 h的累積量是聚乙二醇（PEG）-Au納米顆粒及肝、腎等主要靶器官的10倍之多[5-6]，能顯著抑制腫瘤體積（67%）和質(zhì)量，同時具有很高的生物安全性。本研究旨在探討HeLa細(xì)胞對GSH-Au NCs的攝取能力以及可能帶來的細(xì)胞毒性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

GSH、HAuCl4·3H2O、噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT）、Na2EDTA、Tris-HCI、曲拉通X-100（Triton X-100）、溴化乙錠（美國Sigma公司），NaOH、NaCl（天津江天化工技術(shù)有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（美國Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），3 ku超濾管（美國Millipore公司），HeLa細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所儲存）。健康SPF級BALB/c裸鼠8只（雄性6～8周，體質(zhì)量16～18 g）（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司）。

F4500熒光分光光度計(jì)（日本日立公司），紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），JEM-2100F透射電鏡、7500ce電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）（美國安捷倫公司），Tecan-200酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 GSH-Au NCs的合成與表征

根據(jù)已報(bào)道的合成方法[7]，將0.15 ml濃度為100 mmol/L GSH與 0.5 ml濃度為 20 mmol/L的HAuCl4·3H2O混于5 ml超純水中25℃攪拌，隨后將溫度上升到70℃攪拌過夜，得到的淺黃色溶液即為產(chǎn)物。再用3 ku超濾管除去未反應(yīng)完全的小分子雜質(zhì)。采用透射電鏡觀察合成的GSH-Au NCs的大小及形態(tài)，利用紫外和熒光分光光度計(jì)鑒定特征峰。

1.2.2 細(xì)胞及體內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)

將 HeLa細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于飽和濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。取對數(shù)期生長的細(xì)胞，按每孔5×105個HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)無細(xì)胞的空白對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個復(fù)孔；24 h后更換為含3 mmol/L GSH-Au NCs的培養(yǎng)基1 ml，37℃培養(yǎng)箱中孵育不同時間（0、1、2、6、12、24 h），分別收集各時間點(diǎn)的培養(yǎng)基，以365 nm為激發(fā)波長，測定610 nm處的熒光強(qiáng)度。用空白對照組培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度值減去實(shí)驗(yàn)組各時間點(diǎn)培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度值即為細(xì)胞所攝取的GSH-Au NCs量。

將1.4×107個HeLa細(xì)胞接種于BALB/c雄性裸鼠左側(cè)腋下，待腫瘤生長約為10 mg/kg體質(zhì)量時用于實(shí)驗(yàn)。荷瘤小鼠分為給藥組（GSH-Au NCs處理）和對照組（蒸餾水處理），每組3只。兩組小鼠分別腹腔注射0.2 ml濃度為3 mmol/L的GSH-Au NCs水溶液和等體積的蒸餾水，24 h后脫頸處死后取出腫瘤組織稱質(zhì)量，微波消解后利用ICP-MS檢測金（Au）元素含量。

1.2.3 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

將HeLa細(xì)胞種于96孔板內(nèi)，每孔6×103個細(xì)胞，每組5個復(fù)孔；培養(yǎng)24 h后對照組更換新鮮培養(yǎng)基，給藥組則更換含不同濃度（0.003、0.01、0.03、0.1、0.3 mmol/L）GSH-Au NCs的培養(yǎng)基，每孔總體積均為100 μl；給藥24、48 h后加入10 μl MTT，孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶，搖床晃動15 min后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對GSH-Au NCs的細(xì)胞攝取率和存活率進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 GSH-Au NCs的表征

圖1A、1B分別為GSH-Au NCs在200～450 nm的紫外吸收光譜圖和在450～800 nm的熒光光譜圖。從圖1A可看出，GSH-Au NCs在390 nm處呈特征吸收肩峰。同時，當(dāng)以365 nm為激發(fā)波長時，可發(fā)現(xiàn)GSH-Au NCs的發(fā)射峰位于610 nm附近，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[8]。透射電鏡結(jié)果顯示，GSH-Au NCs的大小分布比較均勻，平均粒徑約為3 nm（圖1C），這與之前的研究結(jié)果一致[8-9]。使用化學(xué)還原法，可合成出不同尺寸的GSH-Au NCs，但不同尺寸納米團(tuán)簇的光學(xué)性質(zhì)差異很大[10-14]。如由10～12個Au原子構(gòu)成的Au10-12納米團(tuán)簇吸收峰約在365 nm，但無任何熒光[9]；Au25納米團(tuán)簇的吸收峰約位于650 nm，熒光發(fā)射峰位于670 nm；而Au29-37納米團(tuán)簇的吸收峰位于390 nm，熒光發(fā)射峰位于610 nm。因此，通過紫外和熒光光譜研究，可確定本研究中的合成產(chǎn)物為GSH-Au29-37納米團(tuán)簇。由于GSH是一種小肽分子，不僅具有小的分子質(zhì)量，還具有良好的生物相容性，為此，筆者將進(jìn)一步研究GSH-Au NCs的細(xì)胞攝取和毒性。

2.2 細(xì)胞及體內(nèi)腫瘤攝取實(shí)驗(yàn)

圖2顯示了時間對HeLa細(xì)胞攝取GSH-Au NCs的影響。從圖中可以看到，當(dāng)攝取1 h時，GSHAu NCs的細(xì)胞攝取率為（8.13±2.40）%；攝取2 h時，細(xì)胞攝取率為（10.34±2.89）%；隨著攝取時間增加到6、12、24 h，相應(yīng)的細(xì)胞攝取率分別為（43.56± 4.28）%、（54.57±4.05）%、（73.13±3.20）%，分別與1、2 h時比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且6、12、24 h的細(xì)胞攝取率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上表明在24 h內(nèi)細(xì)胞攝取率逐漸升高，24 h時達(dá)最高值（73.13%）。筆者進(jìn)一步研究了體內(nèi)腫瘤攝取情況。圖3呈現(xiàn)了給藥24 h后，小鼠HeLa腫瘤組織對GSH-Au NCs的攝取。從圖中可以看出，對照組（腹腔注射蒸餾水）小鼠體內(nèi)的Au含量為（7.8±3.0）ng/g，幾乎可以忽略。Au為重金屬，在正常生物體內(nèi)的含量可以忽略。然而，在GSH-Au NCs處理24 h后，腫瘤組織攝取的Au含量為（320±15）ng/g，即（1.34±0.20）%ID/g（%ID/g指每克組織中Au元素的百分含量）。納米材料在腫瘤組織中的攝取，既與納米顆粒的形狀相關(guān)，又與納米顆粒的尺寸相關(guān)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)尺寸越小，其EPR效應(yīng)越明顯，在腫瘤組織中的攝取就越高[15]。同時，發(fā)現(xiàn)GSH配體具有較好的生物相容性，可最大程度地保護(hù)納米團(tuán)簇免受生物環(huán)境的破壞，有效防止內(nèi)皮網(wǎng)狀細(xì)胞的吞噬，具有較好的血液穩(wěn)定性和體內(nèi)穩(wěn)定性[16]。筆者所在課題組最新研究的幾類GSH保護(hù)的納米團(tuán)簇也表現(xiàn)出高穩(wěn)定性、高效腎清除、高腫瘤特異性及低毒等特性[8-9,17]，這與本研究的結(jié)果一致。9.67）%；當(dāng)濃度增加至0.3 mmol/L時，24 h時的細(xì)胞存活率為（86.00±10.65）%?？梢姴煌瑵舛鹊腉SH-Au NCs與HeLa細(xì)胞作用24 h后，對HeLa細(xì)胞的存活率會有輕微影響，隨著濃度的升高細(xì)胞存活率逐漸降低，抑制作用更為明顯，GSH-Au CNs濃度為0.3 mmol/L時的HeLa細(xì)胞存活率降為對照組（GSH-Au CNs濃度為0）的86%（P＜0.05）。當(dāng)用GSH-Au CNs處理HeLa細(xì)胞48 h時，各濃度組的細(xì)胞存活率與對照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明GSH-Au NCs進(jìn)入細(xì)胞后不會產(chǎn)生長期或嚴(yán)重的不良影響。已有研究報(bào)道GSH是一種良好的表面活性劑，可通過獨(dú)特的共價(jià)結(jié)構(gòu)和GSH-Au NCs結(jié)合，形成穩(wěn)定的納米團(tuán)簇[1]。因此GSH-Au NCs具有較低的細(xì)胞毒性。結(jié)合細(xì)胞和動物體內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，GSH-Au NCs有望作為一種新型的功能材料廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是腫瘤治療和成像等方面。

圖1 谷光甘肽保護(hù)的超小金納米團(tuán)簇的表征

圖2 時間對HeLa細(xì)胞攝取GSH-Au NCs的影響

圖3 荷瘤小鼠腹腔注射蒸餾水與GSH-Au NCs 24 h后腫瘤組織攝取的金元素含量

圖4 不同濃度的GSH-Au NCs與HeLa細(xì)胞作用24、48 h后的細(xì)胞存活率

3 結(jié)論

本研究采用化學(xué)還原法合成了GSH-Au NCs，通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，納米團(tuán)簇的尺寸約為3 nm，其發(fā)光峰位于610 nm。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明，HeLa細(xì)胞對GSH-Au NCs具有較高的攝取，且細(xì)胞攝取率隨攝取時間的延長而提高。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，GSH-Au NCs在給藥24 h后，具有較高的腫瘤攝取。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSH-Au NCs對HeLa細(xì)胞活性影響較小。GSH-Au NCs處理HeLa細(xì)胞24、48 h后，其細(xì)胞毒性較低?？傊珿SH-Au NCs具有小尺寸、低毒和腫瘤攝取高效的特性，有望用于腫瘤治療和成像等領(lǐng)域。

利益沖突 無

2.3 細(xì)胞毒性

圖4表明了不同濃度的GSH-Au NCs對HeLa的細(xì)胞毒性。用MTT法研究了0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3 mmol/L濃度下的GSH-Au NCs對HeLa細(xì)胞的毒性。從圖4可看出，0.003 mmol/L GSH-Au NCs處理HeLa細(xì)胞24 h時的細(xì)胞存活率為（94.00±

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Study of glutathione protected gold nanoclusters on HeLa cytotoxicity

Wang Junying,Xue Xuhui,Zhang Xiaodong,Sun Yuanming
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College;Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Tianjin 300192,China Corresponding author:Sun Yuanming,Email:sunyuanming@irm-cams.ac.cn

Objective To investigate the effects of glutathione protected gold nanoclusters(GSH-Au NCs) on HeLa cytotoxity.Methods Fluorescence intensity were measured on GSH-Au NCs containing medium treated cells using fluorescence spectrophotometer at different time points.GSH-Au NCs uptake by HeLa cells at 1,2,6,12 and 24 h were investigated through fluorescent spectrophotometer.In vivo tumor uptake was also investigated on BALB/c tumor-bearing mice through inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS)at 24 h after intraperitoneal injection of 0.2 ml GSH-Au NCs(3 mmol/L)and distilled water(control group)respectively.The cytotoxicity of GSH-Au NCs at different doses(0.003-0.3 mmol/L)was tested at 24 and 48 h using MTT assay after interaction with HeLa cells.Results The uptake efficiency of GSH-Au NCs by HeLa cells kept increasing and reached maximum of 73.13%at 24 h.The results of tumor-bearing mice indicated that the tumor tissue had higher uptake efficiency after 24 h(320±15)ng/g than that of control group(intraperitoneal injection of distilled water),and the difference was stastically significant(P＜0.05).HeLa cells were treated with different concentrations of GSH-Au NCs for 24 h,and GSHAu NCs had a slight effect on cell viability.With the increase of GSH-Au NCs dose,the inhibition effects on growth of HeLa cells enhanced.The cell activity of HeLa cells treated with 0.3 mmol/L GSH-Au NCs for 24 h reduced to 86% compared with that of control group(the concentration of GSH-Au NCs was 0)(P＜0.05),while there was no significant difference between the survival rate of different concentrations of GSH-Au NCs group and the control group for 48 h. Conclusions GSH-Au NCs have neglectable cytotoxity on HeLa cells even though both in vitro and in vivo uptakeare high.GSH-Au NCs are suitable for biomedical application such as imaging,drug loading and targeted drug delivery.

Glutathione protected gold nanoclusters; Cytotoxicity; HeLa cells

NationalNaturalScienceFoundationofChina(81471786);NaturalScienceFoundationofTianjin (14JCYBJC26700,13JCQNJC13500);Institute of Radiation Medicine&Chinese Academy of Medical Sciences Research Fund(1558)

孫元明，Email:sunyuanming@irm-cams.ac.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．02．005

國家自然科學(xué)基金（81471786）；天津市自然科學(xué)基金（14JCYBJC26700，13JCQNJC13500）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所發(fā)展基金（所探1558）

2016-01-06）