唐紅波 張彤 陶曉軍 杜博 馮欣 張其清

100006北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院藥事部（唐紅波、馮欣）；300192天津,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點實驗室（唐紅波、張彤、陶曉軍、杜博、張其清）

乙酰普魯蘭納米粒子與牛血清白蛋白的相互作用

唐紅波 張彤 陶曉軍 杜博 馮欣 張其清

100006北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院藥事部（唐紅波、馮欣）；300192天津,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點實驗室（唐紅波、張彤、陶曉軍、杜博、張其清）

目的 考查乙酰普魯蘭納米粒子（PANs）與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，為研究PANs體內(nèi)藥代動力學(xué)特征奠定基礎(chǔ)。 方法 將不同濃度的PANs溶液和BSA溶液混合，應(yīng)用熒光法和圓二色譜（CD）法考察二者間的相互作用，計算PANs與BSA結(jié)合的締合常數(shù)（Kq），觀測PANs-BSA抗尿素變性的作用。結(jié)果 PANs對BSA熒光的影響具有濃度相關(guān)性，PANs溶液（0.015～0.25 mg/ml）與BSA（0.25 mg/ml）的締合常數(shù)Kq從2.64×104增高至3.55×105；在尿素或加熱條件下，PANs-BSA溶液和BSA溶液的CD光譜具有相似的變化趨勢。結(jié)論 PANs對BSA的熒光光譜具有顯著影響，但PANs未影響尿素和高溫對BSA的變性作用。

乙酰普魯蘭； 牛血清白蛋白； 納米粒子； 熒光光譜； 圓二色譜

0 引 言

在藥物遞送系統(tǒng)（Drug delivery systems）研究中，納米粒子進入血液循環(huán)后，表面立即被多種蛋白尤其血清白蛋白覆蓋，形成蛋白“corona”[1]。蛋白在納米粒子表面吸附并形成“corona”狀結(jié)構(gòu)不僅對蛋白結(jié)構(gòu)和功能有影響，反之，表面吸附的蛋白對納米粒子的尺寸、形狀、表面電荷、表面結(jié)構(gòu)、聚集態(tài)等物理性質(zhì)變化起著至關(guān)重要的作用[2]，進而影響納米粒子包括藥物納米晶和載體體內(nèi)毒性、藥物釋放、藥代動力學(xué)以及臨床有效性。因此，研究納米粒子與蛋白的相互作用在藥物遞送系統(tǒng)研究中具有極其重要的意義。

天然多糖，包括殼聚糖、普魯蘭、纖維素以及淀粉等，作為具有良好生物相容性的可降解高分子材料，在藥物控/緩釋制劑研究中占有重要地位。近幾年，由于普魯蘭多糖具有生物相容性、低毒性及易功能化修飾性，在多糖類藥物載體研究中逐漸成為研究熱點[3-4]。研究表明，將膽甾醇疏水改性后的普魯蘭納米粒子與人血清白蛋白共孵育發(fā)現(xiàn)，載體的疏水性及表面電荷對納米粒子-蛋白復(fù)合物的形成起著決定性作用。二者相互作用不僅影響蛋白的二級結(jié)構(gòu)，使白蛋白α螺旋減少，同時，蛋白的吸附延緩了藥物釋放[5]。本課題組前期對普魯蘭多糖進行了乙?；杷男约叭~酸修飾，合成了乙酰普魯蘭納米粒子（pullulan acetate nanoparticles,PANs）并對其進行了表阿霉素負載，考察了普魯蘭基納米藥物體外穩(wěn)定性、靶向性、藥代動力學(xué)及生物分布[6-8]。由于不同疏水改性、粒徑、表面電荷等理化性質(zhì)均與白蛋白吸附密切相關(guān)，本研究主要考察PANs與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的相互作用，揭示乙?；蒸斕m（pullulan acetate，PA）類載體對蛋白結(jié)構(gòu)、功能及蛋白對納米粒子物理性質(zhì)的影響，為相關(guān)納米藥物體內(nèi)生物分布及藥效、藥物代謝動力學(xué)研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

普魯蘭多糖（平均分子質(zhì)量為2×105u，醫(yī)藥級）（日本Hayashibara公司），BSA（6.67×104u，電泳級）（天津聯(lián)星生物技術(shù)有限公司），聚乙烯醇（polyvinyl alcohol,PVA）（美國Sigma-Aldrich公司），其他試劑均為市售分析純。

VarioSkan Flash全波長多功能讀數(shù)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Avanti J-25低溫離心機（美國Beckman Coulter公司），J-815圓二色譜儀（circular dichroism spectrometer,CDS）（日本 Jasco公司）。

1.2 方法

1.2.1 PANs的制備

按照課題組前期方法[8]制備PANs。將100 mg PA溶于10 ml二甲基甲酰胺中，在電磁攪拌下將上述溶液滴加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的PVA溶液中；4℃條件下18 000 r/min低溫離心15 min，收集PANs；用去離子水進行分散，探頭超聲處理3 min（輸出功率為100 W，采用間歇脈沖工作方式：脈沖寬度為2.0 s，間歇時間為2.0 s），將PANs稀釋至實驗所需濃度。

1.2.2 PANs-BSA復(fù)合物的制備

將一定質(zhì)量濃度的PANs溶液（0～2 mg/ml）和BSA溶液（0.5 mg/ml）混合并稀釋至一定濃度，在室溫下避光孵育2 h，即得PANs-BSA復(fù)合物。

利用熒光分光光度計檢測復(fù)合物的熒光光譜，激發(fā)波長為295 nm，掃描范圍為300～460 nm（激發(fā)和發(fā)射單色器的狹縫寬度分別為2.5、5.0 nm），進一步確定PANs和BSA的締合情況。

1.2.3 熒光法檢測PANs和BSA之間的虛擬締合常數(shù)

將 0.5 ml系列質(zhì)量濃度的 PANs溶液（0～0.25 mg/ml）和0.5 ml BSA溶液（0.25 mg/ml）混合并稀釋至2.0 ml，在室溫下避光放置4 h；然后對混合物進行熒光掃描，激發(fā)波長為295 nm，掃描范圍為300～460 nm，并檢測 342 nm處的發(fā)射強度，對PANs的質(zhì)量濃度作圖，并按以下公式計算PANs和BSA之間的虛擬締合常數(shù)Kq[9]

式中：[Q]為納米粒子溶液的摩爾濃度，I0和I分別為BSA加入PANs前后的熒光強度。

1.2.4 圓二色譜法檢測PANs-BSA復(fù)合物性質(zhì)

用CDS記錄PANs-BSA復(fù)合物的遠紫外圓二色譜（circular dichroism，CD）圖，掃描范圍為200～300 nm，石英池光程為1 cm。各參數(shù)設(shè)定如下：分辨率為0.2 nm，掃描速率為100 nm/min，狹縫寬度為1nm，響應(yīng)時間為1s，靈敏度為20mdeg。記錄結(jié)果為3次掃描的平均值，BSA的質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml。

將一定量的蛋白變性劑尿素溶液（2、4、6、8、10 mmol/ml）加入BSA溶液或PANs-BSA混懸液，用CDS檢測222 nm處的平均橢圓度，并對尿素濃度作曲線，考察PANs對抗變性劑的情況。

按同樣方法制備PANs-BSA復(fù)合物，研究復(fù)合物中BSA的熱穩(wěn)定性，從20℃升溫至100℃，以0.75℃/min的速度加熱樣品，記錄222 nm處平均橢圓度的變化。

2 結(jié)果

2.1 PANs-BSA復(fù)合物粒徑分析

將一定體積的PANs溶液（0.25 mg/ml）分別與質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml和0.025 mg/ml的BSA溶液混合后，動態(tài)光散射數(shù)據(jù)顯示：平均粒徑從192.2 nm分別增至195.4 nm和201.5 nm，雖然肉眼觀察溶液狀態(tài)無明顯改變，但其粒徑增加表明BSA吸附于納米粒子表面并形成復(fù)合物。同時，高質(zhì)量濃度的BSA沒有低質(zhì)量濃度組粒徑變化明顯，說明高質(zhì)量濃度條件下BSA分子有部分穿插于普魯蘭納米粒子中，形成緊密復(fù)合物狀態(tài)，而低質(zhì)量濃度條件下BSA吸附于納米粒子表面形成疏松態(tài)[10]。

2.2 PANs-BSA復(fù)合物熒光強度及虛擬締合常數(shù)的測定

BSA的等電點為4.7，分子質(zhì)量為6.7×104u，是由585個氨基酸組成的單鏈傳輸?shù)鞍住SA具有17個二硫鍵和2個色氨酸殘基（Trp135和Trp214），且半胱氨酸Cys34位含有1個自由巰基。BSA中的色氨酸殘基在295 nm的激發(fā)波長下產(chǎn)生熒光，其最大發(fā)射波長為342 nm；而PANs在上述范圍內(nèi)不發(fā)射熒光，對BSA存在不同程度的熒光猝滅效應(yīng)。因此，若加入PANs后，BSA的熒光強度減弱，說明PANs與BSA之間的締合作用改變了兩者結(jié)合位點附近BSA的三級結(jié)構(gòu)。當(dāng)BSA的質(zhì)量濃度為0.25 mg/ml時，通過改變PANs的質(zhì)量濃度（0～0.25 mg/ml），兩者混合后的熒光強度如圖1所示，在PANs-BSA復(fù)合物的形成過程中，隨著PANs質(zhì)量濃度的增加，BSA在342 nm處的熒光發(fā)射強度逐漸降低，2 h時和混合即刻（0 h）相比，熒光發(fā)射強度變化不顯著，說明復(fù)合物形成速度較快。

圖1 不同質(zhì)量濃度的PANs與質(zhì)量濃度為0.25 mg/ml的BSA混合后的熒光強度

當(dāng)PANs在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，可采用Stern-Volmer分析來估算PANs和BSA（0.25 mg/ml）之間的締合常數(shù)（Kq），該常數(shù)反映了兩種物質(zhì)間的締合情況。測定342 nm處的熒光強度，對PANs的質(zhì)量濃度（0.015～0.25 mg/ml）作圖（圖2），然后按公式計算求得Kq，對應(yīng)的Kq值分別為2.64×104、6.21×104、8.21×104、1.81×105和3.55×105，說明PANs和BSA之間存在著較強的相互作用，且隨著PANs質(zhì)量濃度的增加相互作用增強。

2.3 CD法檢測PANs-BSA復(fù)合物的性質(zhì)

由圖3可知，加入PANs前后，BSA的CD光譜在221 nm和208 nm處均出現(xiàn)2個負峰，為α-螺旋的典型譜圖，表明BSA以及PANs-BSA復(fù)合物中均存在α-螺旋結(jié)構(gòu)。同時，加入PANs后，負峰位置上移，說明PANs與BSA之間發(fā)生了締合，導(dǎo)致BSA的平均殘基摩爾橢圓度絕對值減小，PANs與BSA的相互作用導(dǎo)致BSA分子的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

在考察蛋白變性劑尿素對BSA和PANs-BSA蛋白穩(wěn)定性的影響時發(fā)現(xiàn)，游離的BSA在加入尿素（2～10 mmol/ml）后，CD光譜在208與222 nm處的2個負峰隨著尿素濃度的增加而向上遷移（圖4A）；PANs-BSA復(fù)合物在加入尿素后，CD光譜的變化也很明顯，且峰形幾乎與游離BSA具有相同的特征（圖4B）。尤其當(dāng)尿素濃度增至6 mmol/ml時，CD光譜的峰形呈變性蛋白的無規(guī)卷曲構(gòu)型的特征，說明BSA發(fā)生了變性，BSA分子中的α-螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞。圖5為變性劑尿素存在下，游離BSA和不同質(zhì)量濃度的PANs與BSA混合后的復(fù)合物在222 nm處的平均橢圓度和尿素濃度的關(guān)系曲線。游離BSA在222 nm處的平均橢圓度隨尿素濃度的增加變化較大；同時，隨著復(fù)合物中PANs含量的增加，復(fù)合物在222 nm處的平均橢圓度的變化趨勢與游離BSA一致，未見PANs的加入使復(fù)合物有顯著對抗蛋白變性的能力。

進一步考察游離和復(fù)合的BSA水溶液的熱變性趨勢發(fā)現(xiàn)，以0.75℃/min升溫模式從20℃加熱至100℃時，當(dāng)溫度達到60℃時，游離BSA在222 nm處平均橢圓度迅速上升，證實該溫度為BSA的變性溫度。加熱PANs-BSA復(fù)合物后BSA的CD光譜的形狀改變與游離BSA也基本一致，說明PANs與BSA混合形成復(fù)合物后，加熱仍對BSA的二級結(jié)構(gòu)造成了破壞。（圖6）

3 討論

藥物與白蛋白相互作用的研究主要包括蛋白-藥物結(jié)合位點數(shù)與結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位置、結(jié)合力類型和機理探討等[5，11]。蛋白在溶液中存在多種二級結(jié)構(gòu)，在加入納米粒子后，由于蛋白與納米粒子結(jié)合，或多或少會對蛋白構(gòu)型產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生一些變化，如折疊以及去折疊等。研究蛋白與藥物相互作用的主要方法有熒光法、平衡透析法、CD法、紫外光譜法和紅外光譜法等[9，12]，通常采用多種方法結(jié)合研究蛋白構(gòu)型的變化。BSA是一種典型的球狀蛋白，性質(zhì)比較穩(wěn)定，其分子中含有色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光的激發(fā)下，通過考察納米粒子對蛋白的熒光碎滅，可獲取許多納米粒子進入體液中的可能特征。

圖5 BSA和PANs-BSA復(fù)合物的平均橢圓度（222 nm）和尿素濃度的關(guān)系曲線

圖6 溫度對BSA和PANs-BSA圓二色光譜的影響

研究結(jié)果表明，BSA影響了納米粒子的粒徑，且隨著PANs質(zhì)量濃度的增加，BSA的熒光發(fā)射強度逐漸降低，這可能是由于PANs同BSA之間的締合作用使BSA發(fā)生了熒光猝滅；混合后2 h時和混合即刻相比，熒光發(fā)射強度變化不顯著，說明PANs與BSA混合后，迅速影響其熒光強度，具有濃度效應(yīng)關(guān)系。雖然該法是目前檢測兩親性表面活性劑和蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法，但Kq值的大小僅僅反映BSA分子中的色氨酸殘基和PANs分子中疏水結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，而實際上BSA與PANs之間不僅存在疏水相互作用，由于其分子中含有大量的極性基團（—COOH、—OH），兩者間還可能存在氫鍵等弱相互作用。

CD光譜可提供蛋白和核酸的二級結(jié)構(gòu)信息，也可檢測配體與生物大分子的結(jié)合作用[2，11]。CD光譜分區(qū)如下：紫外區(qū)段（190～240 nm），主要生色團是肽鏈，這一波長范圍的CD光譜包含著生物大分子主鏈構(gòu)象的信息；近紫外區(qū)段（240～300 nm），占支配地位的生色團為芳香胺基側(cè)鏈，這一區(qū)域可給出“局域”側(cè)鏈間相互作用的信息；波長＞300 nm的區(qū)段（包括可見區(qū)段），對CD光譜的貢獻主要來自含有金屬離子的生色團，這一波段的CD光譜對金屬離子的氧化態(tài)、配位態(tài)以及鏈－鏈間的相互作用較為敏感。本研究考查了BSA、PANs-BSA復(fù)合物以及對抗變性劑尿素和高溫的橢圓度值變化趨勢，結(jié)果表明PANs使BSA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，α-螺旋數(shù)目隨著變性程度增加而減少，說明PANs與BSA之間具有相互作用，這種相互作用可能是蛋白的吸附，也可能是因為納米粒子周圍蛋白“corona”的形成，但這種相互作用還不能使BSA免受變性劑尿素和高溫的影響。

4 結(jié)論

PANs和BSA充分混合后能形成復(fù)合物，其締合常數(shù)高達3.55×105；但PANs-BSA復(fù)合物與游離BSA相比，其對抗變性劑和高溫的能力未見顯著增強。本研究為普魯蘭基納米粒子與蛋白間相互作用的研究提供了科學(xué)依據(jù)，而蛋白對普魯蘭載藥納米粒子穩(wěn)定性和藥物釋放行為等影響尚待進一步考察。

利益沖突 無

（圖2～4見封三）

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Interaction between bovine serum albumin and pullulan acetate nanoparticles

Tang Hongbo,Zhang Tong,Tao Xiaojun,Du Bo,Feng Xin,Zhang Qiqing
Department of Pharmacy,Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University,Beijing 100006, China(Tang HB,Feng X);Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials,Tianjin 300192,China(Tang HB,Zhang T, Tao XJ,Du B,Zhang QQ) Corresponding author:Zhang Qiqing,Email:zhangqiq@126.com;Feng Xin,Email:fengxin1115@126.com

Objective To investigate the interaction of pullulan acetate nanoparticles(PANs)and bovine serum albumin(BSA),and to provide the basis for in vivo pharmacokinetic study of PANs.Methods Mixed solutions of different concentration of PANs and BSA solution was prepared,the interaction was studied by fluorescence quenching method and circular dichroism(CD)measurement.Apparent quenching constant(Kq)between the PANs and BSA was calculated,and the anti-stress effect induced by urea and heating of PANs-BSA solution was observed. Results The fluorescence spectrum of BSA was affected by PANs on density-related manner,and Kqcalculated by the modified Stern-Volmer plot increased from 2.64×104to 3.55×105with the concentration of PANs increased from 0.015 mg/ml to 0.25 mg/ml.With the denaturation of urea or heating,the CD spectrum of PANs-BSA and free BSA had the similar variation tendency.Conclusions The fluorescence spectrum display results show that interaction between PANs and BSA exists,but the interaction does not protect the BSA from degeneration by urea and heating.

Pullulan acetate; Bovine serum albumin; Nanoparticles; Fluorescence spectrum; Circular dichroism

National Natural Science Foundation of China(81301322)

張其清，Email：zhangqiq@126.com；馮欣，Email：fengxin1115@126.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．02．004

國家自然科學(xué)基金（81301322）

2015-12-22）