陳宏，賈緯，聶毅磊，羅立津，陳星偉

(福建省微生物研究所福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350007)

對水葫蘆有殺草活性的菌株S63的分離篩選

陳宏，賈緯，聶毅磊，羅立津，陳星偉

(福建省微生物研究所福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350007)

采用水葫蘆瓊脂平板和氨氮平板初篩及點(diǎn)種于水葫蘆莖處的方法，得到使水葫蘆莖部病變黑斑的菌株，考察其對光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)水葫蘆的生長抑制效果，獲得對水葫蘆生長有強(qiáng)抑制作用的菌株S63，鑒定為假單胞菌屬。露天培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果表明，加入該菌液0.5%～2%(體積分?jǐn)?shù))的試驗(yàn)組發(fā)病率為41.2%～100%，高于對照組19.4%～33.3%的發(fā)病率;試驗(yàn)組葉片的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的酶活均顯著高于對照組。表明該菌對水葫蘆有一定的除草活性。

水葫蘆;生長抑制;假單胞菌屬;生物防治

泛濫的水葫蘆(Eichhornia crassipes)往往引起河道堵塞，對水產(chǎn)養(yǎng)殖、航道運(yùn)輸、水利發(fā)電以及農(nóng)林灌溉等造成嚴(yán)重影響，破壞生態(tài)環(huán)境。水葫蘆的防治方法主要有物理防除、化學(xué)除草劑及生物防治等。目前我國消除水葫蘆最有效的辦法還是靠機(jī)械或人工打撈，但需要花費(fèi)大量人力物力，每年人工打撈費(fèi)用可高達(dá)1億元［1］，且打撈速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上水葫蘆爆發(fā)繁殖的速度。盡管化學(xué)控制效果明顯，但水葫蘆種群往往恢復(fù)迅速，且除掉水葫蘆后常滋生大量浮游生物，起不到持效作用［2］，同時化學(xué)殺草劑往往專一性較弱，還可能對水生環(huán)境造成生態(tài)危害。生物防治一般具有環(huán)境友好、效果持久和成本低等優(yōu)點(diǎn)，其中利用微生物及其代謝產(chǎn)物是生物防治研究中一個較活躍的領(lǐng)域［3-5］。水葫蘆爆發(fā)的真正原因在于水體的富營養(yǎng)化，許多研究表明水中的營養(yǎng)物質(zhì)，尤其氮、磷等元素對水葫蘆的生長有相關(guān)關(guān)系［6-10］，減少環(huán)境污染是抑制水葫蘆生長較為有效的措施。本研究采用氨氮平板和水葫蘆瓊脂平板，從水葫蘆病株及其生長環(huán)境中分離到既可降解氨氮又能抑制水葫蘆生長的菌株，經(jīng)過進(jìn)一步的復(fù)篩，獲得目的菌株S63，并進(jìn)行了菌株鑒定和殺草活性初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源從水葫蘆病株及其水體中分離和純化獲得的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基水葫蘆瓊脂:水葫蘆莖40 g，加少許水磨碎取汁，瓊脂20 g，用自來水定容到1 000 mL;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯100 g，葡萄糖10 g，瓊脂2 g，蒸餾水1 000 mL;氨氮平板培養(yǎng)基［11］:檸檬酸三鈉3 g，NH4H2PO40.4 g，KH2PO41 g，NaCl 3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4;發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨0.5 g，酵母膏1.5 g，葡萄糖5 g，K2HPO40.1 g，NaCl 1.5 g自來水1 000 mL，pH 7.2;水葫蘆培養(yǎng)液:采用Hoagland溶液配方［12］;以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌30 min，含有葡萄糖的培養(yǎng)基，應(yīng)將葡萄糖單獨(dú)在115℃滅菌15 min后再加入培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離取水葫蘆病株的葉片，用次氯酸溶液擦洗，無菌水沖洗3遍，研磨，取汁，涂布于水葫蘆瓊脂平板培養(yǎng)基上。從水葫蘆病株所處的水體中，取1 mL水樣涂布在水葫蘆瓊脂平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 d。挑取單菌落，并進(jìn)行菌株純化，將純化后的菌株，保存在PDA斜面。將純化菌株接種于氨氮平板上，28℃培養(yǎng)2～4 d，挑取保存產(chǎn)生透明圈的菌株。取正常生長的水葫蘆植株，用70%酒精反復(fù)擦洗其莖部表面，無菌水沖洗數(shù)次，剪取約5 cm長的小段，置于墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加入少許無菌水，以保持一定的濕度，將初篩獲得的純化菌株接種于水葫蘆莖處，置室溫培養(yǎng)，選取能致水葫蘆莖部出現(xiàn)黑斑的菌株。將上述篩選獲得的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)2～4 d，吸取菌液按0.5%、1%、2%(體積分?jǐn)?shù))比例加入到水葫蘆生長液中，取正常生長的水葫蘆植株移栽于上述培養(yǎng)液中，以不添加菌液為對照，每組作3個重復(fù)。于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，選取可抑制水葫蘆生長的菌株為復(fù)篩菌株。

1.2.2 菌株鑒定將培養(yǎng)3 d的菌株接種于40 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶(100 mL)，于35℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后制成菌懸液，離心收集菌體，采用CTAB/NaCl法提取菌株基因組DNA。通過利用細(xì)菌測序的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對前期提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進(jìn)行純化測序，測序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行blast比對。

1.2.3 水葫蘆自然生態(tài)培養(yǎng)模擬實(shí)驗(yàn)將生長正常的水葫蘆植株10株移栽于8 L添加2%(體積分?jǐn)?shù))菌液的生長培養(yǎng)液中，同時以不添加菌液作為空白對照，均設(shè)3組重復(fù)，露天培養(yǎng)，觀察和記錄水葫蘆生長情況。以葉片染病情況計算發(fā)病率。水葫蘆病情分級標(biāo)準(zhǔn)［12］:0級，葉片上無任何病斑;1級，葉片上少數(shù)病斑，總面積小于三分之一;2級，葉片上病斑總面積大于三分之一，小于三分之二;3級，葉片上病斑面積大于三分之二;4級，葉片全部枯萎。水葫蘆葉片的發(fā)病率和病情指數(shù)分別按以下公式計算:發(fā)病率(100%) =染病葉片數(shù)/總?cè)~片數(shù)×100;葉片病情指數(shù)=(Σ(發(fā)病級別×該級的葉片數(shù))/(總?cè)~片數(shù)×4))×100%。

1.2.4 酶的分析丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性測定方法，參見鄒奇編寫的方法［13］。過氧化物酶(POD)活性測定:采用李合生的愈創(chuàng)木酚比色法［14］。

1.2.5 菌株對富營養(yǎng)化水體的凈化試驗(yàn)取富營養(yǎng)化水樣1 000 mL，按110 000的體積比例接入S63的菌液，以不添加菌液為空白對照組，均設(shè)立3個平行組，室溫間歇曝氣(即曝氣12 h，靜止不曝氣12 h)，不同時間段取樣測定水體中氨氮和化學(xué)需氧量(COD)的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從水葫蘆病株和其生長水體中分離到139株可以在水葫蘆瓊脂平板上生長的菌株，將這些菌株分別在氨氮平板上點(diǎn)種，于28℃培養(yǎng)，挑取平板上呈現(xiàn)透明圈的菌株作為初篩菌株。再將這些菌株在水葫蘆莖上點(diǎn)種，室溫培養(yǎng)3～4 d后，在水葫蘆莖上出現(xiàn)黑斑的菌株有36株。

將上述獲得的36株菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)2～4 d，取培養(yǎng)液分別按0.5%、1%、2% (體積分?jǐn)?shù))比例加入到水葫蘆生長液中，將水葫蘆植株置于光照培養(yǎng)箱中25℃光照培養(yǎng)15 d，觀察水葫蘆生長狀況，其中有6株菌(S29、S39、S44、S57、S60、S63)的菌液在加入后第5天使水葫蘆的生長受到抑制，至第15天植株均枯黃衰萎。選取較早出現(xiàn)抑制現(xiàn)象、抑制效果比較穩(wěn)定的S63菌株作為后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株。

2.2 菌株鑒定

將菌株S63進(jìn)行菌種鑒定，先提取菌株總DNA，再進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增和序列測定，通過BLAST軟件與NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫的16S rRNA進(jìn)行比對，結(jié)果表明，其大小為1 393 bp，與Pseudomonas protegens strain Azi15的同源性最高，相似性達(dá)99%，S63屬于假單胞菌屬。該菌株能利用葡萄糖、果糖、甘露醇、甘油、檸檬酸鈉、乙酸鈉、琥珀酸鈉、肌醇，不利用蔗糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖、棉籽糖、木糖、阿拉伯糖、酒石酸甲鈉、草酸鈉，不水解纖維素，能液化明膠，胨化牛奶，石蕊牛奶還原褪色，不產(chǎn)硫化氫。

2.3 菌株S63在水葫蘆露天培養(yǎng)中的抑制作用

在水葫蘆培養(yǎng)液中按2%(體積分?jǐn)?shù))的比例加入菌液，經(jīng)過11批次15 d的露天培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)組的發(fā)病率為41.2%～100%，病情指數(shù)為30.9%～96.4%，對照組發(fā)病率19.4%～33.3%，病情指數(shù)為7.4%～20.2%，見表1、圖1所示。

表1 水葫蘆加菌液試驗(yàn)組和對照組在露天培養(yǎng)的發(fā)病狀況比較Table 1Comparision of the disease condition between the test group and control group during the outdoor cultivation

續(xù)表1

圖1 露天培養(yǎng)水葫蘆Fig.1Outdoor cultivation of water hyacinth

2.4 酶活性的測定

植物在逆境條件下會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，從而引起一系列生理生化變化。病原菌或植物毒素入侵后，植物體內(nèi)有大量活性氧迅速產(chǎn)生，高濃度的活性氧將危害植物自身細(xì)胞，因此植物體內(nèi)存在清除活性氧的防御酶系，例如SOD、CAT和POD等。

MDA［15］是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，毒性很強(qiáng)，對生物膜的結(jié)構(gòu)與功能具有嚴(yán)重?fù)p傷作用，其含量高低體現(xiàn)了氧自由基的毒害作用的大小，成為反映膜脂過氧化強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，因此植物在逆境中遭到傷害的程度可以通過MDA的含量來反饋。加入菌液后水葫蘆葉片中的MDA含量顯著高于對照，說明菌液對葉片的細(xì)胞膜有較強(qiáng)的毒害作用，從而抑制了水葫蘆植株的生長。SOD能將歧化為H2O2，是清除超氧陰離子自由基的關(guān)鍵酶之一，酶活性常與植物的抗氧化脅迫能力正相關(guān)。POD具有將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O的作用，是植物體內(nèi)擔(dān)負(fù)清除H2O2的主要酶類。CAT是植物中極為重要的逆境生理酶，能夠清除植物體內(nèi)過多的過氧化氫，減少其對細(xì)胞的過氧化傷害，圖2的結(jié)果表明加入菌液后水葫蘆葉片的SOD、CAT、POD酶的活性顯著提高。

圖2 試驗(yàn)組葉片與對照組葉片酶活的檢測結(jié)果Fig.2Results of enzyme activity on test group and control group

2.5 菌株S63對富營養(yǎng)化水質(zhì)的凈化試驗(yàn)

取富營養(yǎng)化水樣置室溫間歇曝氣，不同時間段取樣測定對照組與試驗(yàn)組的氨氮和COD，結(jié)果表明加入S63菌液對氨氮和COD降解效果顯著高于對照(圖3)。加菌曝氣3 d的水樣明顯較對照清澈。

圖3 菌株S63對富營養(yǎng)化水樣的凈化試驗(yàn)Fig.3The test of purification about eutrophic water with S63

3 討論

本研究篩選得到的菌株S63對水葫蘆的生長有抑制作用，加入菌液后水葫蘆葉片中的MDA含量及SOD、POD和CAT酶活均顯著高于對照，說明對葉片的細(xì)胞膜產(chǎn)生了較強(qiáng)的毒害作用，能引起植株的膜脂過氧化，造成植株過氧化損傷，致病率可達(dá)41.2%～100%，病情指數(shù)為30.9%～96.4%，明顯高于對照組。表明該菌有一定的殺草活性，但關(guān)于其損傷的機(jī)理和使用的安全性還需要進(jìn)一步的研究。

人工、機(jī)械防除或化學(xué)除草劑難以根治水葫蘆的泛濫，生物防治方法是國際上認(rèn)同的控制入侵生物的發(fā)展方向，采用對環(huán)境友好、成本低廉、選擇性強(qiáng)的微生物及其代謝產(chǎn)物作為殺草劑成為研究熱點(diǎn)［17-20］。水葫蘆病原菌的研究始于20世紀(jì)60年代，但目前具有商業(yè)化應(yīng)用價值的微生物除草劑還很少見，且大部分都為致病真菌［3-5，16-17］，很少有關(guān)于水葫蘆致病細(xì)菌的研究報道。菌株S63是假單胞菌屬，擴(kuò)大了水葫蘆生防菌的種類來源。該菌株還具有降解水體中氨氮的特性，對遏制水體富營養(yǎng)化有一定作用，而水葫蘆的爆發(fā)與水環(huán)境富營養(yǎng)化的關(guān)系密切，因此該菌株及其代謝物對水葫蘆泛濫具有標(biāo)本兼治的防治作用，提供了一個水葫蘆生物防除的新思路，本研究的結(jié)果對這一領(lǐng)域的產(chǎn)品研發(fā)具有一定的參考價值，值得進(jìn)一步深入的研究。

［1］梁寶忠.我國每年人工打撈水葫蘆費(fèi)用高達(dá)1億元［EB/ OL］.［2014-07-25 23:35J］.http://www.agri.cn/V20/ZX/ nyyw/201407/t20140725_3980876.htm

［2］高雷，李博.入侵植物鳳眼蓮研究現(xiàn)狀及存在的問題［J］.植物生態(tài)學(xué)報，2004，28(6):735-752.

［3］Shabana Y M，Elwakil M A，Charudattan R.Effect of media，light and pH on growth and spore production by Alternaria eichhorniae，a mycoherbicide agent for waterhyacinth/Wirkung von Medium，Licht und pH auf das Wachstum und die Sporenproduktion von Alternaria eichhorniae，einem Mykoherbizid gegen die Wasserhyazinthe［J］.Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz/Journal of Plant Diseases and Protection，2000:617-626.

［4］Dagno K，Lahlali R，Jijakli M H，et al.Present status of the development of mycoherbicides against water hyacinth:successes and challenges.A review［J］.Biotechnologie，Agronomie，Société et Environnement，2012，16(3):360-368.

［5］Ray P，Hill M P.Microbial agents for control of aquatic weeds and their role in integrated management［J］.CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources，2013，(8):1-9.

［6］楊紅玉.水葫蘆生長的環(huán)境影響因素，機(jī)理及規(guī)律研究［D］.福州:福建師范大學(xué)，2006.

［7］Yi Q，Kim Y，Tateda M.Evaluation of nitrogen reduction in water hyacinth ponds integrated with waste stabilization ponds［J］.Desalination，2009，249(2):528-534.

［8］周喆，李文文，尤民生.水體中氮素對水葫蘆生長發(fā)育的影響［J］.華東昆蟲學(xué)報，2011，18(1):55-60.

［9］陳雄偉，鄭春梅，李曉丹，等.不同氮營養(yǎng)水平對水葫蘆根系活力的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(3):1657-1659.

［10］傅明輝，陳肖麗，嚴(yán)國花.光照和不同氮素對水葫蘆谷氨酰胺合成酶活性的影響［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，(3):635-639.

［11］彭云華.利用氨氮平板測定法初篩優(yōu)勢微生物菌株［J］.城市公用事業(yè)，2005，19(4):16-18.

［12］丁義.水葫蘆病原菌的分離與鑒定及炭疽菌(Colletotrichum spp.)YBH菌株的生物學(xué)特性研究［D］.上海:上海交通大學(xué)，2006.

［13］鄒奇.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［14］李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，1999:118-119.

［15］張秋芳，劉波，官雪芳，等.水葫蘆防除劑“殺草克樂”對水葫蘆若干生理特性的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，26(5):1812-1815.

［16］王小欣，盧柳吉，李其利，等.水葫蘆生防菌的分離篩選及初步鑒定［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，44(8):1291-1294.

［17］Okunowo W O，Osuntoki A A，Adekunle A A，et al.Occurrence and effectiveness of an indigenous strain of Myrotheciumroridum Tode:Fries as a bioherbicide for water hyacinth(Eichhornia crassipes)in Nigeria［J］.Biocontrol Science＆Technology，2013，23(12):1387-1401.

［18］徐文平，陶黎明.以微生物代謝物進(jìn)行除草劑開發(fā)的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代農(nóng)藥，2011，10(4):1-8.

［19］強(qiáng)勝，陳世國.生物除草劑研發(fā)現(xiàn)狀及其面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)［J］.雜草科學(xué)，2011，29(1):1-6.

［20］KarimDagno R L，Diourté M，Jijakli M H.Present status of the development of mycoherbicides against water hyacinth:successes and challenges.A review［J］.Biotechnologie，Agronomie，Sociétéet Environnement，2012，16(3):360-368.

Isolation and Screening of Herbicidal Active Strain S63 against Water Hyacinth(Eichhornia crassipes)

CHEN Hong，JIA Wei，NIE Yi-lei，LUO Li-jin，CHEN Xing-wei
(Fujian Inst.of Microbiol.，F(xiàn)ujian Prov.Key Lab.of Screening for Novel Med.(Microb.)Products，F(xiàn)uzhou 350007)

Water hyacinth(Eichhornia crassipes)(WH)agar plate and ammonia-nitrogen plate and dibbling on WH’s stem method were adopted to screen initially herbicidal active strains which could make WH infected with pathological change by black spot.The growth inhibition effects of WH was observed in illumination incubator，and obtained strain S63 that strongly inhibited the growth of WH，and identified as a species of the genus of Pseudomonas.The results of outdoors’cultivation experiments showed that the occurrence of WH tested groups with 0.5%～2%of the strain’s fermentation broth was at 41.2%～100%，higher than the occurrence of control groups at 19.4%～33.3%;and enzyme activities of malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)，peroxidase(POD) and catalase(CAT)in tested WH’s leaves were significantly higher than the control groups，suggested that the strain had a certain herbicidal activity against WH.

water hyacinth(Eichhornia crassipes);growth inhibition;Pseudomonas;bio-control

Q93－3

A

1005－7021(2016)04－0022－05

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.004

福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2013Y0013)

陳宏女，碩士，高級工程師。研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。E-mail:peaceful88@163.com

2015-11-02;

2016-01-12