胡輔華，許玉俊，劉麗林，季 建，于榮國，李筱榮

（1.天津港口醫(yī)院眼科 300456；2.天津港口醫(yī)院急診科 300456；3.天津市第五中心醫(yī)院眼科 300456；4.天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院眼科 300074）

隨著我國經(jīng)濟(jì)水平和國民消費(fèi)水平的提高，人民的飲食方式發(fā)生了改變，糖尿病的發(fā)病率也逐年增加［1］。糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的并發(fā)癥之一，是糖尿病微血管病變的重要表現(xiàn)，是一種特異性的眼底改變，可嚴(yán)重影響患者的視力及生活質(zhì)量，眼底鏡下表現(xiàn)為新生血管的廣泛形成［2］。糖尿病視網(wǎng)膜病變的形成機(jī)制較為復(fù)雜，主要為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生和新生血管形成，這一過程與機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)［3－4］。α－硫辛酸（α－lipoic acid，α－LA）是一種作用較強(qiáng)的抗氧化劑，可以有效清除自由基，從而發(fā)揮其作用［5］。本次研究應(yīng)用72只Wistar大鼠作為研究對象，觀察α－LA對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠VEGF表達(dá)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用72只健康的雄性Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，體質(zhì)量為200～220g，平均（210.4±6.2）g，由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號14－0212。將72只大鼠分為4組：空白對照組（A組）12只，糖尿病模型組（B組）24只，α－LA治療組（C組）24只，葡萄糖干預(yù)組（D組）12只。

1.1.2 藥物 α－LA注射液（南京新百藥業(yè)有限公司，批號20131107），鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司，純度大于98.0%），0.5%硫酸阿托品滴眼液（Alcon Labratories Inc，批號：20140103）。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建及藥物處理 所有大鼠均進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，B和C組大鼠按照60mg／kg的劑量腹腔注射STZ（溶于0.1mol／L的檸檬酸緩沖液，pH＝4.5），72h后采大鼠尾靜脈血測空腹血糖，血糖大于或等于16.7mmol／L為糖尿病模型構(gòu)建成功；A組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。4組大鼠均進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，C組大鼠每天下午3：00用100mg／kg的α－LA灌胃；A組和B組大鼠于同一時刻用等量的生理鹽水灌胃，D組同一時間用等量的5.0%葡萄糖溶液灌胃。于4、8、12周分別測量各組生存大鼠的體質(zhì)量和胰島素抵抗。胰島素抵抗：采用7170A全自動生化檢測儀檢測大鼠的空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS），計(jì)算穩(wěn)態(tài)胰島素抵抗指數(shù)（HOMA－IR）。HOMA－IR＝FINS×FPG／22.5。比較各組大鼠的FPG、FINS和 HOMA－IR。

1.2.2 大鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá) 于4、8、12周分別從A組和D組隨機(jī)挑選4只大鼠，B和C組各隨機(jī)挑選8只大鼠，觀察視網(wǎng)膜的VEGF的表達(dá)，標(biāo)本的制備方法如下：用10.0%的水合氯醛麻醉大鼠并在無菌條件下處死，摘取大鼠眼球，切除眼球前節(jié)，于顯微鏡下撕取大鼠的視網(wǎng)膜組織。組織切片用二甲苯脫蠟后用乙醇進(jìn)行梯度水化，將切片放于檸檬酸緩沖液（10mL，pH＝6.0）微波修復(fù)抗原5min。用3.0%的過氧化氫處理切片，清除過氧化物酶活性。將一抗滴注在處理好的切片上，室溫下靜置60min；用PBS沖洗切片，滴加二抗后在37℃水浴1h。兔抗鼠VEGF單克隆抗體（一抗，即用型）羊抗兔抗體（二抗，即用型）均由上海我武生物科技有限公司提供。用PBS沖洗切片后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液染色，之后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染、切片脫水后封存。所有樣本均分別進(jìn)行2次染色和制片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。免疫組織化學(xué)染色的評分結(jié)果［6］如下：0分，陰性（－），組織染色結(jié)果為陰性或僅有不到5.0%的細(xì)胞著色；1分，弱陽性（＋），5.0%～＜25.0%的細(xì)胞出現(xiàn)中等及以下的染色；2分，陽性（＋＋），25.0%～50.0%的細(xì)胞出現(xiàn)中等程度的染色或10.0%～50.0%的細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的染色；3分，強(qiáng)陽性（＋＋＋），超過50.0%的細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)程度的染色。

1.2.3 大鼠血清超氧化鈉歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和IL－6的檢測 大鼠在處死前經(jīng)頸靜脈取血2mL，置于抗凝試管中，分離血清。SOD檢測采用氮藍(lán)四唑（NBT）法，試劑盒由碧云天生物科技有限公司提供；GSH和IL－6檢測均采用ELISA檢測，試劑盒由上海信裕生物科技有限公司提供。

1.2.4 眼底檢查 第12周末，B～D組大鼠在處死前進(jìn)行眼底檢查：大鼠滴注0.5%硫酸阿托品滴眼液進(jìn)行散瞳后，在眼底鏡下觀察大鼠的視網(wǎng)膜新生血管的形成，評價標(biāo)準(zhǔn)如下［7］：Ⅰ期表現(xiàn)為視網(wǎng)膜有微動脈瘤或存在小出血點(diǎn)；Ⅱ期表現(xiàn)為視網(wǎng)膜存在黃白色“硬性滲出”有或無出血斑；Ⅲ期表現(xiàn)為視網(wǎng)膜出現(xiàn)白色“軟性滲出”，伴或不伴有出血斑，上述Ⅳ～Ⅵ為單純型糖疾病視網(wǎng)膜病變。Ⅳ期表現(xiàn)為視網(wǎng)膜出現(xiàn)新生血管，伴或不伴有玻璃體出血；Ⅴ期為眼底檢查出現(xiàn)新生血管和纖維增生；Ⅵ期為在Ⅴ期的基礎(chǔ)上出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫落，上述Ⅳ～Ⅵ為增殖型糖疾病視網(wǎng)膜病變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，組間比較運(yùn)用單因素方差分析，等級資料采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病大鼠的模型構(gòu)建情況 72h后，B～D組大鼠模型構(gòu)建成功，B組大鼠FPG為（21.72±4.28）mmol／L，C組為（21.54±4.96）mmol／L，D組為（21.83±4.77）mmol／L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A組大鼠FPG為（4.57±0.15）mmol／L，與B、C、D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組大鼠體質(zhì)量（210.5±5.2）g，B組（211.2±5.7）g，C 組（209.8±5.8）g，D組（208.7±3.4）g，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量和胰島素抵抗的變化 不同時刻各組大鼠的體質(zhì)量、FPG、FINS和 HOMA－IR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組大鼠不同時刻的體質(zhì)量、FPG、FINS和 HOMA－IR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量和FPG的變化（）

表1 各組大鼠體質(zhì)量和FPG的變化（）

a：P＜0.05，大鼠不同時刻觀察指標(biāo)相互比較。

HOMA－IR 4時間 體質(zhì)量（g） FPG（mmol／L） FINs（μU／mL）周A組 264.4±16.24.56±0.12 17.8±1.5 3.56±0.37 B組 225.7±9.821.56±4.52 25.7±2.6 4.65±0.47 C組 245.9±11.4a17.61±3.25a 18.2±1.7 3.92±0.39a D組 207.8±11.426.17±4.82 27.2±2.8 5.62±0.828周A組 275.6±17.84.67±0.23 17.6±1.4 3.54±0.32 B組 235.6±11.223.44±4.67 25.5±2.7 4.67±0.52 C組 259.8±13.5a15.42±1.34a 18.5±1.4 3.88±0.35a D組 220.7±8.528.82±2.77 27.5±2.9 5.67±0.7912周A組 289.8±23.54.58±0.17 17.9±1.6 3.64±0.38a B組 255.7±13.124.79±4.12 25.8±2.9 4.72±0.48 C組 268.7±16.5a12.81±0.97a 18.7±1.8 3.98±0.38 D組234.6±11.727.87±3.97 27.8±2.5 5.65±0.81

2.3 各組大鼠的SOD、GSH和IL－6水平變化 不同時刻的各組大鼠的SOD、GSH和IL－6水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠的SOD、GSH和IL－6水平變化（）

表2 各組大鼠的SOD、GSH和IL－6水平變化（）

VEGF 4時間 SOD（U／L） GSH（mmol／L）IL－6（ng／L）周A組 120.9±8.917.2±2.55.2±0.50.2±0.1 B組 72.5±2.611.7±0.97.7±0.82.3±0.4 C組 89.7±3.513.7±0.86.4±0.51.7±0.3a D組 67.5±1.7 9.9±0.67.9±0.62.7±0.1a 8周

續(xù)表2 各組大鼠的SOD、GSH和IL－6水平變化（）

續(xù)表2 各組大鼠的SOD、GSH和IL－6水平變化（）

a：P＜0.05，大鼠不同時刻的觀察指標(biāo)相互比較。－：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

時間 SOD（U／L） GSH（mmol／L）IL－6（ng／L）120.4±11.217.1±1.95.1±0.60.1±0.1 B組 74.6±3.1 11.4±1.08.4±1.02.7±0.3 C組 98.7±2.9 14.5±1.16.2±0.31.5±0.2a D組 65.9±1.2 10.0±0.59.1±0.92.9±0.2a 12周A組 121.5±7.9 17.8±1.75.4±0.60.3±0.1 B組 73.6±2.8 11.5±0.98.5±0.92.8±0.5 C組 109.5±3.7 15.9±1.25.9±0.7 －D組VEGF A組55.9±1.6 10.1±0.410.2±1.5 －

2.4 各組大鼠的VEGF免疫組織化學(xué)染色評分 不同時刻的各組大鼠免疫組織化學(xué)染色評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組和D組大鼠不同時刻的免疫組織化學(xué)染色評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝7.342，P＜0.05）。見表2。

2.5 糖尿病大鼠的眼底檢查結(jié)果 12周末，B、C、D組大鼠的眼底鏡檢查GR分期結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同GR分期糖尿病大鼠的眼底檢查結(jié)果（n）

3 討 論

隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國糖尿病的發(fā)生率逐漸提高，給我國的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶了極大的負(fù)擔(dān)。糖尿病患者可出現(xiàn)多種并發(fā)癥，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病微血管病變的最典型表現(xiàn)之一，可分為單純型和增殖型，后者引起失明的可能性更大，增殖型突出表現(xiàn)為視網(wǎng)膜新生血管和纖維組織的形成，部分患者甚至出現(xiàn)視網(wǎng)膜的脫落，患者可出現(xiàn)視力的嚴(yán)重下降甚至失明［8］。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者視網(wǎng)膜新生血管形成與視網(wǎng)膜組織中VEGF的表達(dá)和對血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)作用密切相關(guān)，上述過程與糖尿病患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。因此作為一種多功能的強(qiáng)效抗氧化劑，α－LA在糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治中具有一定的應(yīng)用價值［9］。本次研究中，應(yīng)用72只 Wistar大鼠作為研究對象，觀察α－LA對糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜病變和VEGF表達(dá)的影響。

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用STZ腹腔注射的方法構(gòu)建糖尿病視網(wǎng)膜病變的大鼠模型，STZ是一種DNA烷基化試劑，對胰腺的胰島β－細(xì)胞具較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。STZ可以誘發(fā)多種動物的糖尿病模型，多用于大鼠和小鼠的糖尿病模型構(gòu)建［10］。經(jīng)過72h后，B～D組大鼠出現(xiàn)明顯的高血糖，說明大鼠的糖尿病模型構(gòu)建成功。

糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種因素的共同作用，糖尿病患者高血糖、血脂代謝異常和炎性反應(yīng)共同作用，可以導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列的病理生理變化，包括內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）活性的下降和一氧化氮的合成減少，血管內(nèi)皮損傷和氧化應(yīng)激的［11］。α－LA可以有效清除機(jī)體代謝差的活性氧物質(zhì)及自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并改善eNOS活性，減輕血管內(nèi)皮的損傷。同時，α－LA的應(yīng)用可以改善機(jī)體的胰島素抵抗，發(fā)揮降血糖的作用［12］。本次研究中，C組患者的HOMA－IR明顯低于B組和D組。

與A組大鼠相比，B～D組的大鼠的SOD、GSH水平明顯降低，說明糖尿病的體內(nèi)存在較強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)；C組大鼠不同時刻的SOD活性和GSH水平均明顯高于B組，高于D組，且隨著時間的推移呈上升趨勢，說明α－LA可以有效清除大鼠體內(nèi)的氧化活性物質(zhì)。C組視網(wǎng)膜組織VEGF表達(dá)水平較D組降低，說明α－LA可以抑制VEGF蛋白在視網(wǎng)膜上的表達(dá)，干預(yù)早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展。比較各組大鼠的IL－6水平，不同時刻C組的炎性反應(yīng)程度低于B、D組。

大量研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視網(wǎng)膜的VEGF表達(dá)水平升高［13］，高血糖可以激活蛋白激酶C介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路從而活化NADPH氧化酶，激活的NADPH氧化酶可以直接誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生并上調(diào)VEGF的表達(dá)水平［14］；同時，高血糖的刺激可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜微小血管的損傷，導(dǎo)致供血供氧的不足，缺氧狀態(tài)可促進(jìn)VEGF的表達(dá)和新生血管的形成［15］。

綜上所述，α－AL的應(yīng)用可以有效抑制大鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)，這一作用可能與改善胰島素抵抗、抑制慢性炎癥和氧化應(yīng)激多個環(huán)節(jié)相關(guān)。同時，研究中，C組α－AL治療大鼠的VEGF水平仍輕微高于A組健康大鼠，提示糖尿病視網(wǎng)膜病變可能與多個環(huán)節(jié)調(diào)控相關(guān)。

［1］翁建平.對糖尿病流行病學(xué)、循證醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)研究的探索［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2010，31（2）：166－171，178.

［2］Zhang X，Saaddine JB，Chou CF，et al.Prevalence of diabetic retinopathy in the United States，2005－2008［J］.JAMA，2010，304（6）：649－656.

［3］郝燕燕，付蓉花，盧振威，等.α－硫辛酸對早期糖尿病性視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜組織血管內(nèi)皮生長因子和蛋白激酶－C表達(dá)的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，44（6）：1201－1204.

［4］Nicholson BP，Schachat AP.A review of clinical trials of anti－VEGF agents for diabetic retinopathy［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2010，248（7）：915－930.

［5］Inman DM，Lambert WS，Calkins DJ，et al.α－Lipoic acid antioxidant treatment limits glaucoma－related retinal ganglion cell death and dysfunction［J］.PLoS One，2013，8（6）：e65389.

［6］董宇，崔治華，宋鄂，等.糖尿病性視網(wǎng)膜病變血管內(nèi)皮生長因子與糖基化終末產(chǎn)物的關(guān)系［J］.中國老年學(xué)雜志，2011，31（14）：2693－2695.

［7］胡利，李東豪，陳慧.糖尿病患者血糖控制相關(guān)因素與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的關(guān)系［J］.中華眼底病雜志，2011，27（3）：210－213.

［8］Moradian S，Ahmadieh H，Malihi M，et al.Intravitreal bevacizumab in active progressive proliferative diabetic retinopathy［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2008，246（12）：1699－1705.

［9］Barber AJ，Gardner TW，Abcouwer SF.The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52（2）：1156－1163.

［10］Tang J，Kern TS.Inflammation in diabetic retinopathy［J］.Prog Retin Eye Res，2011，30（5）：343－358.

［11］易茜璐，于明香.糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，37（5）：604－607.

［12］Rochette L，Ghibu S，Richard C，et al.Direct and indirect antioxidant properties ofα－lipoic acid and therapeutic po－tential［J］.Mol Nutr Food Res，2013，57（1）：114－125.

［13］陳慶中，張靜楷，黃利明，等.血管內(nèi)皮生長抑制因子在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清及玻璃體中的變化［J］.中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2013，31（12）：1163－1168.

［14］SimóR，Sundstrom JM，Antonetti DA.Ocular Anti－VEGF therapy for diabetic retinopathy：the role of VEGF in the pathogenesis of diabetic retinopathy［J］.Diabetes Care，2014，37（4）：893－899.

［15］Hammes HP，F(xiàn)eng Y，Pfister F，et al.Diabetic retinopathy：targeting vasoregression［J］.Diabetes，2011，60（1）：9－16.