楊明遠(yuǎn)，徐 光，王玉妍

（1.長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院心胸外科，吉林長(zhǎng)春130051；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院感染科；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

先天性心臟病與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子－634G＞C的相關(guān)性研究

楊明遠(yuǎn)1，徐 光2，王玉妍3＊

（1.長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院心胸外科，吉林長(zhǎng)春130051；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院感染科；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是先天性畸形中最常見(jiàn)的一類，約占各種先天畸形的28%，它是指在胚胎發(fā)育時(shí)期由于心臟及大血管的形成障礙或發(fā)育異常而引起的解剖結(jié)構(gòu)異常，或出生后應(yīng)自動(dòng)關(guān)閉的通道未能閉合（在胎兒屬正常）的情形。先天性心臟病發(fā)病原因很多，以遺傳因素和環(huán)境因素為主。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生［1］。本研究通過(guò)檢測(cè)血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因多態(tài)性位點(diǎn)－634G＞C的單核苷酸多態(tài)性，探討先天性心臟病與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子－634G＞C基因型的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

病例組為長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院心外科收治的先天性心臟病患兒77例，其中男41例，女36例，年齡為6月齡－13歲，所有患兒均經(jīng)過(guò)查體、超聲心動(dòng)圖及手術(shù)明確診斷。對(duì)照組為長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院門診體檢健康兒童共75例，其中男38例，女37例，年齡為5月齡－12歲，均經(jīng)過(guò)超聲檢查已除外CHD，并且無(wú)其他先天性疾病或腫瘤，肝、腎功能均正常。所有對(duì)象均為漢族，兩組年齡，性別差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

具有以下一項(xiàng)者為排除病例，①新生兒期嬰兒，卵圓孔未閉及動(dòng)脈導(dǎo)管未閉存在，因兩者仍有自行閉合的可能，不作為研究樣本；②CHD患兒出現(xiàn)艾森曼格綜合征，肺動(dòng)脈壓力極高，心內(nèi)缺損的血流方向發(fā)生改變，血流動(dòng)力學(xué)與未出現(xiàn)艾森曼格綜合征的CHD患兒有差異，所以不作為研究樣本；③CHD患兒合并有染色體疾病，如唐氏綜合征，不作為研究樣本。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的提取和擴(kuò)增 病例組及對(duì)照組患兒清晨空腹6小時(shí)以上，采集靜脈血2ml，EDTA抗凝管保存，采集后2小時(shí)內(nèi)，離心機(jī)3 500轉(zhuǎn)／分，離心5分鐘，抽出血漿，置2ml離心管中。血細(xì)胞及血漿均在－80℃冰凍保存。飽和酚－氯仿法提取DNA。Taqman探針檢測(cè)VEGF－634G＞C的單核苷酸多態(tài)性。①紫外光／可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定樣本的DNA含量。②選擇反應(yīng)體系20μl：2XTaq－Man Master Mix 10μl，40XTaqman SNP Assays 0.5μl，樣本DNA3μl，無(wú)核酸酶水6.5μl。③使用7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Taqman探針工作：步驟1：初活化50℃2min，步驟2：活化95℃10 min，步驟3：變性95℃15sec：，步驟4：退火／延伸60℃1min，步驟3和步驟4循環(huán)40次。④讀取數(shù)據(jù)及生成結(jié)果圖。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料用x—±s表示。樣本的均數(shù)比較，首先檢驗(yàn)方差齊性，然后采用t檢驗(yàn)。兩組間比較采用成組χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 VEGF－634G＞C的基因型

通過(guò)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，病例組和對(duì)照組的基因型有：純合子GG型，雜合子GC型，純合子CC型，見(jiàn)圖1－3。如僅有紅色曲線抬升，綠色曲線水平，基因型為純合子GG型；如紅色曲線和綠色曲線均有抬升，基因型為雜合子GC型；如紅色曲線水平，綠色曲線抬升，基因型為純合子CC型。

2.2 病例組和對(duì)照組VEGF－634G＞C等位基因頻率的比較

病例組共有樣本77個(gè)，－634G＞C多態(tài)性位點(diǎn)等位基因總數(shù)為154個(gè)，其中G基因103個(gè)，C基因51個(gè)；對(duì)照組共有樣本75個(gè)，－634G＞C多態(tài)性位點(diǎn)等位基因總數(shù)為150個(gè)，其中G基因114個(gè)，C基因36個(gè)。兩組等位基因G／C頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2＝1.55，P＞0.05，差異無(wú)顯著性，見(jiàn)表1。

圖1 基因型GG指數(shù)圖

圖2 基因型GC指數(shù)圖

圖3 基因型CC指數(shù)圖

表1 兩組VEGF－634G＞C等位基因比較［n（%）］

2.3 病例組和對(duì)照組基因型GG、GC和CC頻率的比較

病例組的基因型為三種，分別為：GG型38例，GC型27例，CC型12例；對(duì)照組基因型也為三種，分別為：GG型53例，GC型8例，CC型14例。病例組與對(duì)照組三種基因型的分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2＝12.16，P＜0.05，差異有顯著性，見(jiàn)表2。

表2 病例組和對(duì)照組VEGF－634G＞C基因型分布比較［n（%）］

2.4 VEGF－634G＞C基因型與CHD易感性

比數(shù)比（OR）：指病例組中暴露人數(shù)與非暴露人數(shù)的比值除以對(duì)照組中暴露人數(shù)與非暴露人數(shù)的比值。比數(shù)比是反映疾病與暴露之間關(guān)聯(lián)強(qiáng)度的指標(biāo)。如果OR＜1，說(shuō)明疾病的相對(duì)危險(xiǎn)度低，如果OR＞1，說(shuō)明疾病的相對(duì)危險(xiǎn)度高。本研究的病例組和對(duì)照組中，VEGF－634G＞C的基因型分為：GG型為91例、GC型35例、CC型26例。其中兩組的GC型所占比例差異性大。GG型OR值為0.4，GC型OR值為4.5，CC型OR值為0.8。這說(shuō)明在3種基因型中，GC基因型最易導(dǎo)致CHD的發(fā)生，它可能是CHD的易感基因型。見(jiàn)表3。

表3 VEGF－634G＞C基因型患CHD的比數(shù)比

3 討論

CHD是小兒先天性畸形疾病中最常見(jiàn)的一類，并且也是小兒最常見(jiàn)的心臟病。我國(guó)CHD的發(fā)生率為6‰－8‰。近些年，CHD的發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)［2］。CHD被認(rèn)為是一種復(fù)雜性狀疾病，它的形成原因主要與下列因素有關(guān)：1、遺傳因素（內(nèi)在因素）：如單基因突變，染色體畸變，多基因病變和先天性代謝紊亂；2、環(huán)境因素（外在因素）：孕早期風(fēng)疹病毒感染，柯薩奇病毒感染，孕期攝取鋰鹽，糖尿病，酗酒，過(guò)量輻射，藥物，高齡孕婦，高原地區(qū)生活等。VEGF是調(diào)節(jié)心臟血管生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子之一。VEGF－634G＞C多態(tài)性位點(diǎn)的突變，與CHD的形成密切相關(guān)［3］。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，CHD患兒和健康兒童的VEGF－634G＞C的基因型均為三種：GG型，GC型和CC型。雖然兩組的G／C等位基因頻率無(wú)差異，但是兩組基因型的分布有明顯差異。其中，GC型在兩組的差異性較大，并且GC型引起CHD的比數(shù)比為4.5，其余兩型的比數(shù)比均＜1。所以，GC型可能是CHD發(fā)病的易感基因型。原因可能是：－634G＞C的不同的基因型其生理活性不同［4］。－634C的生理活性強(qiáng)于－634G。有研究發(fā)現(xiàn)，－634C可能會(huì)影響內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），使其表達(dá)增加。這樣，VEGF的表達(dá)發(fā)生異常。另外有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF影響心臟血管發(fā)育主要是受到VEGF的特異性受體控制：VEGF受體－1和VEGF受體－2［5］。這兩種受體作用的協(xié)同效應(yīng)，構(gòu)成了新的血管形成的基礎(chǔ)。VEGF的表達(dá)異常，可能與VEGF受體－1和VEGF受體－2結(jié)合程度就會(huì)有差異，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的通透性發(fā)生變化，VEGF濃度的改變影響了心血管的發(fā)育，可能導(dǎo)致CHD的形成［6］?？傊?，在胚胎期心臟發(fā)育階段，VEGF對(duì)心臟發(fā)育在時(shí)間上和空間上有非常準(zhǔn)確的調(diào)控。一旦多態(tài)性位點(diǎn)－634G＞C發(fā)生突變，就有可能導(dǎo)致VEGF的表達(dá)異常，血中VEGF的濃度發(fā)生改變，影響VEGF對(duì)于心臟發(fā)育的調(diào)控，最終導(dǎo)致CHD的出現(xiàn)［7］。

在胚胎期，VEGF－634G＞C的基因突變后，影響了VEGF的表達(dá)。但是每個(gè)胎兒受到的影響的程度不盡相同，有的胎兒影響程度較輕，VEGF的濃度變化小，或者在正常范圍內(nèi)［8］。所以，這類的胎兒在發(fā)育過(guò)程中，心臟的發(fā)育仍然會(huì)按照正常的胎兒發(fā)育，沒(méi)有形成CHD。同樣，有的胎兒由于在胚胎時(shí)期，VEGF的表達(dá)受到的影響較大，VEGF的濃度低于或超過(guò)了正常范圍，導(dǎo)致心臟的發(fā)育異常，最終形成了CHD［9］。因此，即使VEGF的多態(tài)性位點(diǎn)－634G＞C發(fā)生了突變，并且產(chǎn)生了易感CHD的基因型，但是也不一定形成CHD。至于VEGF基因突變后的具體的濃度變化，以及濃度變化對(duì)胚胎影響程度，有待于進(jìn)一步研究［10］。

本研究仍有需要完善的地方：實(shí)驗(yàn)中兩組的樣本量小，無(wú)法對(duì)CHD進(jìn)行分型研究；實(shí)驗(yàn)樣本采集受到了國(guó)籍、地域及種族、環(huán)境的限制；VEGF有多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)只是針對(duì)－634G＞C這一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了探討；實(shí)驗(yàn)中的樣本未采集父母的血樣，對(duì)評(píng)估CHD的遺傳因素可能會(huì)有的影響。

本研究?jī)H證明了VEGF－634G＞C的基因型與CHD的形成有相關(guān)性。但尚不能據(jù)此診斷胎兒是否患有CHD，也未探討針對(duì)CHD形成的機(jī)制如何進(jìn)行基因治療。同時(shí)，鑒于CHD的形成有多種因素參與，多個(gè)基因位點(diǎn)的突變都有可能對(duì)CHD的形成機(jī)制產(chǎn)生影響［11］。所以，我們下一步可能需要擴(kuò)大研究范圍，探討多基因變異的相互作用及其影響，在更深層次，更廣區(qū)域研究CHD的形成機(jī)制以及如何有效的進(jìn)行基因干預(yù)以減少發(fā)病率和死亡率。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究VEGF和CHD的進(jìn)程可以與分子生物學(xué)，遺傳學(xué)，環(huán)境學(xué)等學(xué)科相結(jié)合，為CHD的早期診斷及治療提供理論依據(jù)和實(shí)踐支持。

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2014－11－26）

1007－4287（2015）10－1749－03

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