楊 軍，關(guān)秀文，牛彥鋒，杜寒松，翟榮林，曾 榮，張萬(wàn)里（.黃陂區(qū)人民醫(yī)院外一科，武漢 4000；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院：.胃腸外科；.肝膽外科；4.腫瘤中心，武漢 400）

胃癌的發(fā)病機(jī)制與表觀遺傳學(xué)密切相關(guān)，其中抑癌基因甲基化調(diào)控異常是其最重要的發(fā)病機(jī)制，相關(guān)的基因包括RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1（RASSF1）編碼基因等［1－2］。RASSF1基因是在從3號(hào)染色體短臂克隆獲得的一種新的抑癌基因，所編碼的RASSF1蛋白通過(guò)RAS介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。目前已證實(shí)RASSF1基因在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，且表達(dá)水平與臨床病理因素密切相關(guān)，可用于胃癌患者病情判斷及預(yù)后評(píng)估［3－4］。本研究基于基因甲基化與蛋白質(zhì)表達(dá)的關(guān)系，分析了胃癌患者胃鏡活檢組織RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化水平，探討RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化在胃癌診斷及患者病情判斷、預(yù)后評(píng)估中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年1月至2013年6月行胃鏡檢查的胃癌患者75例納入患者組（GAC組），均經(jīng)體格檢查、影像學(xué)檢查、胃鏡活檢標(biāo)本和手術(shù)切除標(biāo)本病理組織學(xué)檢查確診。75例患者中，男40例、女35例，年齡30～75歲，平均（51.2±12.6）歲。同期胃鏡檢查正常的健康者75例納入對(duì)照組（CON組），男39例、女36例，年齡30～75歲，平均（50.7±12.3）歲。兩組研究對(duì)象間性別構(gòu)成和年齡分布比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 采集GAC組患者胃鏡活檢癌組織和癌旁組織標(biāo)本，以及CON組健康者正常胃組織標(biāo)本。參照基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取組織標(biāo)本DNA，提取后的DNA經(jīng)純化后用于檢測(cè)RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化水平。采用甲基化檢測(cè)試劑盒對(duì)DNA標(biāo)本進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，再對(duì)RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）檢測(cè)RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。引物設(shè)計(jì)采用 Methprimer軟件（http：／／www.urogene.org／cgi－bin／methprimer／methprimer.cgi），引物序列見(jiàn)表1。MSP擴(kuò)增體系為25μL，循環(huán)條件為：95℃10min，95℃1 min、64℃45s、72℃30s循環(huán)25次，72℃10min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后顯影檢測(cè)。

表1 RASSF1基因啟動(dòng)子MSP檢測(cè)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化比較 75例GAC組患者癌組織及癌旁組織標(biāo)本中，47例癌組織標(biāo)本檢出RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化，甲基化率為62.7%，3例癌旁組織標(biāo)本檢出RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化，甲基化率為4.0%。75例CON組健康者正常組織標(biāo)本中，2例檢出RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化，甲基化率為2.7%。GAC組患者癌組織標(biāo)本RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化率高于癌旁組織和CON組健康者正常組織，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癌旁組織和正常組織RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系 胃癌患者癌組織RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化率在不同性別、年齡、病變部位及幽門螺桿菌（HP）感染患者之間的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在不同分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期患者間的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），分化程度高、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期早的胃癌患者RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化率低于分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期晚的患者，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系

3 討 論

RASSF1基因是從3號(hào)染色體短臂克隆獲得的抑癌基因，所編碼的RASSF1蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)，與腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。當(dāng)RASSF1表達(dá)異常時(shí)，失去對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生無(wú)限制的增殖而出現(xiàn)癌變。已有研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1蛋白在消化道腫瘤的診斷及患者病情判斷、預(yù)后評(píng)估中具有分子標(biāo)志物作用［4－6］。研究證實(shí)，胃癌組織RASSF1表達(dá)水平顯著低于健康者正常組織，且其表達(dá)水平與胃癌臨床病理因素緊密相關(guān)。杜鴻等［3］采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測(cè)了胃癌患者RASSF1基因mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中的表達(dá)缺失率顯著高于癌旁組織和正常胃黏膜組織，且其表達(dá)水平與胃癌TNM分期、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性。葉梅等［7］檢測(cè)了胃癌組織RASSF1基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)胃癌組織RASSF1A基因mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示RASSF1A在所有癌旁正常組織中的表達(dá)均為陽(yáng)性，而在胃癌組織中的表達(dá)則明顯減弱或缺失，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)RASSF1AmRNA及蛋白表達(dá)水平與胃癌分期顯著相關(guān)。上述研究報(bào)道均說(shuō)明RASSF11基因表達(dá)缺失與胃癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，同時(shí)說(shuō)明其在胃癌診斷及患者病情判斷、預(yù)后評(píng)估方面具有較大的臨床價(jià)值，但目前對(duì)RASSF1基因表達(dá)缺失導(dǎo)致組織癌變的具體作用機(jī)制尚無(wú)相關(guān)研究。

表觀遺傳學(xué)是基因的核苷酸序列不發(fā)生改變時(shí)，非基因序列改變所導(dǎo)致的基因表達(dá)改變的生命現(xiàn)象，主要包括基因DNA甲基化和組蛋白乙?；日{(diào)控機(jī)制。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，基因組5′CpG二核苷酸胞嘧啶共價(jià)結(jié)合1個(gè)甲基基團(tuán)，形成甲基化CpG（mCpG）。mCpG與DNA甲基結(jié)合蛋白（MBP）結(jié)合或直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動(dòng)子序列結(jié)合，間接抑制基因表達(dá)［8－9］。DNA啟動(dòng)子甲基化除基因突變外最為主要的腫瘤發(fā)病機(jī)制，甲基化水平可準(zhǔn)確反映腫瘤患者病情及預(yù)后，較傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)水平生物標(biāo)志物具有更高的靈敏度和特異度［10－12］?；诒碛^遺傳學(xué)與基因表達(dá)的關(guān)系，以及胃癌組織中RASSF1基因表達(dá)下降的事實(shí)，可以認(rèn)為RASSF1基因表觀遺傳學(xué)改變可能是導(dǎo)致其mRNA和蛋白表達(dá)異常的首要原因。本研究采用MSP技術(shù)對(duì)胃癌患者和健康者胃組織標(biāo)本RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌患者癌組織標(biāo)本RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化率為62.7%，癌旁組織為4.0%，健康者正常胃組織甲基化率為2.7%，癌組織RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化率高于癌旁組織和正常胃組織（P＜0.05），證實(shí)胃癌RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化與其表達(dá)水平的降低密切相關(guān)，RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致其基因表達(dá)水平下降，從而導(dǎo)致RASSF1表達(dá)異常，失去對(duì)細(xì)胞周期的正常調(diào)控，導(dǎo)致正常胃細(xì)胞發(fā)生無(wú)限制增殖而癌變，最終出現(xiàn)胃癌表型。本研究同樣間接證實(shí)可將逆轉(zhuǎn)RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化用于胃癌患者的臨床治療。

本研究比較了胃癌患者癌組織RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化率在不同性別、年齡、病變部位及HP感染患者間的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在不同分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期患者間的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤分化程度越低、最大徑越大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期晚的患者，其RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化率越高，表明RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化與胃癌患者的病情和預(yù)后密切相關(guān)，與RASSF1基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)在胃癌患者病情判斷及預(yù)后評(píng)估中的作用一致，間接證實(shí)基因表達(dá)合乎基因法則，均可作為胃癌患者病情判斷及預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。與手術(shù)切除標(biāo)本對(duì)比，胃鏡活檢組織RASSF1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)可在術(shù)前提供準(zhǔn)確的病情判斷和預(yù)后評(píng)估依據(jù)，具有更為廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。

胃癌的發(fā)病機(jī)制主要與基因表達(dá)異常有關(guān)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境等因素作用于機(jī)體后可導(dǎo)致基因表達(dá)異常，其中基因突變是最早被發(fā)現(xiàn)的，也是最經(jīng)典的胃癌發(fā)病機(jī)制［13－14］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，某些胃癌患者的基因并不存在明顯的突變，但存在基因表達(dá)的異常，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，不依賴于基因堿基序列改變的表觀遺傳學(xué)在胃癌的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，先天性或后天性作用因素均可導(dǎo)致胃癌相關(guān)基因發(fā)生表觀遺傳學(xué)改變，包括基因啟動(dòng)子甲基化和乙?；淖儯罱K導(dǎo)致相關(guān)基因不能正常結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制基因表達(dá)，最終產(chǎn)生胃癌表型［15－16］。目前發(fā)現(xiàn)的與胃癌相關(guān)的基因包括TIMP3基因［17］、上皮型鈣黏附素［18］、WRN 基因［19］和 BNIP3基因［20］等。隨著研究的逐漸深入，相信越來(lái)越多的基因表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制將被發(fā)現(xiàn)參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。目前的研究發(fā)現(xiàn)，與基因突變不同，基因啟動(dòng)子甲基化可被藥物逆轉(zhuǎn)從而使基因重新表達(dá)，因而具有潛在的臨床治療價(jià)值。5－氮雜－2′－脫氧胞苷是目前廣泛報(bào)道的用于逆轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子甲基化的藥物［21］。體外試驗(yàn)表明，5－氮雜－2′－脫氧胞苷具有去甲基化作用，能逆轉(zhuǎn)多種抑癌基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，使其恢復(fù)表達(dá)，進(jìn)而恢復(fù)抑癌功能，并在多種腫瘤細(xì)胞株中得到證實(shí)［22－23］。盡管體外試驗(yàn)證實(shí)5－氮雜－2′－脫氧胞苷具有抑制甲基轉(zhuǎn)移酶，從而逆轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子甲基化的作用，但目前尚無(wú)相關(guān)體內(nèi)試驗(yàn)研究的證實(shí)，因此5－氮雜－2′－脫氧胞苷的臨床應(yīng)用尚存在給藥困難及尚未得到體內(nèi)試驗(yàn)研究證實(shí)等問(wèn)題，極大地限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。然而，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，逆轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子甲基化在非基因突變所致腫瘤中的應(yīng)用終將成為現(xiàn)實(shí)。

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