徐 俊，薛 建，黃 輝，邵雪軍，朱 宏（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215003）

手足口病（HFMD）是以發(fā)熱和手足、口腔等部位皮疹或皰疹性咽峽炎為主要特征的一種嬰幼兒急性傳染病，病原體包括柯薩奇病毒（Cox）A16型（CoxA16）、?？刹《竞湍c道病毒71型（EV71）等，其中以CoxA16、EV71最常見。由于EV71引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等較其他腸道病毒多見，且具有較高的病死率和致殘率，因此日益受到重視［1］。目前，國內(nèi)局部地區(qū)手足口病流行強(qiáng)度較大［2］。本研究對236例HFMD患兒免疫功能進(jìn)行了分析，旨在探討免疫功能變化在HFMD發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，及其與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年7月至2012年5月本院收治的HFMD患兒236例，均符合《手足口病診治指南（2010年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，且外周血EV71、CoxA16RNA檢測均為陽性。236例患兒中，EV71RNA陽性且無并發(fā)癥患兒99例（EV71組），男58例、女41例，平均年齡（2.00±1.06）歲；CoxA16 RNA陽性且無并發(fā)癥患兒110例（CoxA16組），男71例、女39例，平均年齡（2.17±1.33）歲；經(jīng)腦脊液或心肌鈣蛋白檢測確診的合并腦膜腦炎或心肌炎患兒27例（重癥組），包括EV71 RNA陽性患兒19例、CoxA16RNA陽性患兒8例，男15例、女12例，平均年齡（1.83±1.26）歲。同期收治的疝氣患兒24例納入對照組，男18例、女6例，平均年齡（2.22±1.17）歲。4組患兒性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 LC480型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（德國羅氏），Epics XL－MCL型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter），EV71、CoxA16RNA熒光探針試劑盒（廣州中山大學(xué)達(dá)安基因公司），熒光標(biāo)記單克隆抗體（美國BD）。

1.3 方法

1.3.1 外周血EV71、CoxA16RNA檢測 患兒入院后24h內(nèi)采集外周血2mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測EV71、CoxA16RNA，操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.2 淋巴細(xì)胞亞群檢測 患兒入院后24h內(nèi)采集外周血2 mL，肝素抗凝，取50μL混勻全血標(biāo)本與相應(yīng)的熒光標(biāo)記單克隆抗體10μL充分混勻，室溫條件下避光孵育15min后加入250μL溶血素，振蕩混勻后37℃水浴15min，再加入250μL磷酸鹽緩沖液（PBS），振蕩混勻后37℃水浴15min，再加入1 mL PBS振蕩混勻后1 800r／min離心5min，棄上清液，用濾紙吸干管壁，加入250μL PBS，振蕩混勻后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析（one－way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較；P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

各研 究 組 間 CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3－CD19＋、CD3－CD16＋CD56＋、CD19＋CD23＋和CD4＋CD25＋淋巴細(xì)胞亞群百分比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。其中，EV71組、CoxA16組和重癥組CD3＋和CD3＋CD4＋淋巴細(xì)胞亞群百分比均低于對照組（P＜0.05），重癥組CD3＋淋巴細(xì)胞亞群百分比低于EV71組和CoxA16組（P＜0.05），但EV71組和CoxA16組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；重癥組CD3＋CD8＋淋巴細(xì)胞亞群百分比低于對照組（P＜0.05），EV71組、CoxA16組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EV71組、重癥組CD3－CD19＋淋巴細(xì)胞亞群百分比高于對照組（P＜0.05），CoxA16組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；重癥組CD3－CD16＋CD56＋淋巴細(xì)胞亞群百分比高于EV71組、CoxA16組和對照組（P＜0.05），但后3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EV71組、Cox－A16組和重癥組CD19＋CD23＋淋巴細(xì)胞亞群百分比均較對照組升高（P＜0.05），且EV71組較CoxA16組和重癥組升高更明顯（P＜0.05）。EV71組、CoxA16組和重癥組CD4＋CD25＋淋巴細(xì)胞亞群百分比均較對照組升高（P＜0.05）。

表1 各研究組患兒淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果（%，）

表1 各研究組患兒淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果（%，）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與重癥組比較，＃P＜0.05；與CoxA16組比較，ΔP＜0.05；－：表示無數(shù)據(jù)。

組別 n CD3＋ CD3＋CD4＋ CD3＋CD8＋ CD3－CD19＋ CD3－CD16＋CD56＋ CD19＋CD23＋ CD4＋CD25＋.18 13.50±5.98 5.00±2.11 4.77±0.79 EV71組 99 59.11±7.03＊＃ 30.22±6.53＊ 23.92±6.25＃ 26.25±7.27＊Δ 12.00±6.00＃ 14.16±5.61＊＃Δ 6.05±1.45＊CoxA16組 110 60.26±9.29＊＃ 32.82±6.29＊ 22.56±7.90＃ 22.83±6.31 13.00±6.10＃ 12.19±4.16＊ 6.05±1.60＊重癥組 27 54.43±8.03＊ 29.69±7.03＊ 19.96±3.68＊ 25.68±6.5＊ 16.93±5.66＊ 11.19±4.23＊ 5.61±1.39＊F－ 9.581 5.571 3.803 7.875 5.480 25.443 5.846 P對照組 24 66.42±6.62 36.09±5.92 25.52±4.08 20.30±5－ 0.000 0.001 0.011 0.000 0.001 0.000 0.001

3 討 論

HFMD是由腸道病毒感染導(dǎo)致的一類傳染性疾病，常見于嬰幼兒。腸道病毒屬的Cox A組16、4、5、7、9、10型，B組2、5型，?？刹《?3型和EV71等均能引起HFMD，最常見的是CoxA16和 EV71［4－5］。本院2011年7月至2012年月收治的HFMD患兒以CoxAl6和EV71感染居多，大部分患兒臨床表現(xiàn)為手、足斑丘疹或水皰疹及發(fā)熱、咽痛，病程1周左右，預(yù)后良好；少數(shù)出現(xiàn)頭痛、嘔吐、意識障礙、腦膜刺激征等臨床表現(xiàn)，極少數(shù)出現(xiàn)肢體弛緩性癱瘓、心動(dòng)過速、氣急、發(fā)紺、昏迷和呼吸衰竭，屬于重癥患兒［6－7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，EV71或CoxA16感染后，無論普通型還是重癥型HFMD患兒，免疫功能均發(fā)生明顯改變。病毒感染機(jī)體后，參與防御的主要是T淋巴細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞。在病毒入侵初期，作為機(jī)體固有免疫應(yīng)答細(xì)胞的NK細(xì)胞首先產(chǎn)生應(yīng)答，NK細(xì)胞活化后，產(chǎn)生干擾素γ（IFN－γ）、白細(xì)胞介素2（IL－2）、腫瘤壞死因子（TNF）等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)輔助性T淋巴細(xì)胞（Th淋巴細(xì)胞）分化表達(dá)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［8－9］。本研究中，重癥HFMD患兒CD3－CD16＋CD56＋淋巴細(xì)胞亞群百分比較對照組、EV71組和CoxA16組明顯增高，表明重癥患兒機(jī)體內(nèi)的NK細(xì)胞活化程度明顯上調(diào)。

CD3分子主要表達(dá)在T淋巴細(xì)胞表面，是T細(xì)胞成熟的表面標(biāo)志。CD3＋T淋巴細(xì)胞又分為CD3＋CD4＋T細(xì)胞和CD3＋CD8＋T細(xì)胞兩類。CD3＋CD4＋T細(xì)胞主要為Th細(xì)胞，又可分為Th1和Th2型，前者參與機(jī)體對病毒和腫瘤的免疫反應(yīng)，而后者參與對過敏性疾病和寄生蟲的免疫反應(yīng)。CD3＋CD8＋T細(xì)胞又稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，活化后可參與病毒的清除過程［10］。在 HFMD患兒中，CD3＋、CD3＋CD4＋T淋巴細(xì)胞亞群百分比較對照組明顯下降，且重癥患兒下降更顯著，表明HFMD患兒在對抗腸道病毒感染時(shí)，CD3＋、CD3＋CD4＋T細(xì)胞明顯受到抑制，且重癥患兒更為嚴(yán)重。重癥組患兒CD3＋CD8＋T淋巴細(xì)胞亞群百分比明顯下降，CoxA16組和EV71組均無明顯變化，提示重癥患兒對腸道病毒的清除能力明顯下降，CD3＋CD8＋T淋巴細(xì)胞亞群百分比的降低程度可能與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)。

CD4＋CD25＋T細(xì)胞則是一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，能發(fā)揮抑制免疫調(diào)節(jié)的作用［11］。本研究中，HFMD患兒CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞亞群百分比均上升，提示腸道病毒感染后，機(jī)體在CD4＋CD25＋T細(xì)胞的作用下，免疫調(diào)節(jié)作用受到了抑制。

本研究中，HFMD患兒體內(nèi)具有體液免疫功能的B淋巴細(xì)胞CD3－CD19＋亞群及調(diào)節(jié)分化、黏附的CD19＋CD23＋淋巴細(xì)胞亞群百分比較對照組升高。這可能是細(xì)胞免疫功能抑制后，體液免疫功能的相對增高，也可能是機(jī)體在感染腸道病毒后，增強(qiáng)了相應(yīng)的體液免疫能力。此外，EV71組升高較Cox－A16組更明顯，可能是由于EV71感染后抑制細(xì)胞免疫功能的能力更強(qiáng)或增強(qiáng)體液免疫功能的能力更強(qiáng)。

綜上所述，EV71和CoxA16感染所致HFMD患兒體內(nèi)存在免疫功能的紊亂，重癥患兒免疫功能紊亂更為明顯，尤以CD3＋、CD3＋CD8＋和CD3－CD16＋CD56＋亞群的異常更為突出。在臨床診治過程中，應(yīng)盡早對HFMD患兒進(jìn)行CD3＋、CD3＋CD8＋和CD3－CD16＋CD56＋亞群監(jiān)測，了解其動(dòng)態(tài)變化，從而對患兒病情嚴(yán)重程度及預(yù)后作為正確判斷，同時(shí)應(yīng)根據(jù)患兒免疫功能的具體狀態(tài)，給予適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)免疫功能的治療，從而提高治療效果。

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