【摘要】目的 通過熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)2013年沈陽(yáng)地區(qū)采集的327份手足口病病例的病原學(xué)特征，為手足口病的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。方法收集2013年手足口病糞便標(biāo)本321份、咽拭標(biāo)本6份用熒光定量RT-PCR進(jìn)行鑒定。結(jié)果2013年321份手足口病糞便標(biāo)本經(jīng)腸道病毒通用引物PCR檢測(cè)279份為陽(yáng)性，其中HEV-71占44.4%，CV-A16占25.8%，未分型的其他腸道病毒占29.7%。6份手足口病咽拭標(biāo)本均為陰性。結(jié)論 沈陽(yáng)地區(qū)2013年手足口病病原體優(yōu)勢(shì)型別均為HEV-71型。

【關(guān)鍵詞】手足口?。荒c道病毒屬；病原學(xué)檢測(cè)

【中圖分類號(hào)】R-0【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1671-8801（2014）06-0352-01

手足口病(hand， foot and mouth disease， HFMD)是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報(bào)道。能引起HFMD的病毒很多，主要為小RNA病毒科腸道病毒屬的柯薩奇病毒、埃可病毒和新腸道病毒。其中，腸道病毒71型(enterovirus 71， EV71)和柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16， CoxAl6)是引起HFMD的最主要兩種病原[1]，這兩種病毒引起的HFMD臨床癥狀很相似，難以區(qū)分，但由EV71引起的HFMD會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為腦炎，無(wú)菌性腦膜炎易引起中樞神經(jīng)等系統(tǒng)的嚴(yán)重并發(fā)癥[2]，病死率高，并會(huì)引起局部地區(qū)或更大范圍的暴發(fā)。因此，對(duì)引起HFMD兩種最主要病原EV71和CAl6進(jìn)行迅速鑒別診斷顯得尤為重要。本文通過對(duì)2013年沈陽(yáng)地區(qū)321例手足口病病例進(jìn)行病原和流行特征分析，為有效預(yù)防控制手足口病提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集

收集2013年沈陽(yáng)地區(qū)哨點(diǎn)醫(yī)院送檢的糞便及咽拭標(biāo)本共327份（其中321份糞便標(biāo)本，6份咽拭標(biāo)本），檢測(cè)327份標(biāo)本的腸道通用病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型病毒核酸。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1病毒RNA提取

取采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit， 嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行，提取的RNA立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或-80℃保存。

1.2.2熒光定量PCR

1.2.2.1待測(cè)標(biāo)本的Real-time RT-PCR檢測(cè)

使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的腸道病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒、腸道病毒71型核酸檢測(cè)試劑盒和柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行總腸道病毒、EV71和CoxA16檢測(cè)。反應(yīng)體系：RT-PCR反應(yīng)液15μl、逆轉(zhuǎn)錄酶系2μl、Taq酶系3μl，模板RNA 5μl。反應(yīng)條件：40℃，25min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；94℃，3min變性；93℃，15sec，55℃，45sec，40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.2.2結(jié)果判斷

陰性質(zhì)控品：無(wú)典型S型擴(kuò)增曲線或無(wú)Ct值顯示；陽(yáng)性質(zhì)控品：呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤30；表示實(shí)驗(yàn)有效。如果檢測(cè)樣品無(wú)典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值>35，判斷樣品為陰性；如果檢測(cè)樣品呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤35，判斷樣品為陽(yáng)性[3]。

2結(jié)果

2.1HFMD病例標(biāo)本陽(yáng)性率分析

2013年采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，6份咽拭標(biāo)本檢測(cè)均為陰性，321份糞便標(biāo)本中腸道病毒通用引物陽(yáng)性率為86.9%(279/321)，見表1。

2.2 HFMD病例標(biāo)本病原檢測(cè)分析

在2013年采集的321份糞便標(biāo)本中有279份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率86.9%，其中HEV-71占44.4%(124/279)，CV-A16占25.8%(72/279)，其他腸道病毒占29.7%(83/279) 。對(duì)比2013年HFMD病例標(biāo)本的病原檢測(cè)結(jié)果可以看出，HEV-71為主要病原型別。

表1 2013年HFMD病例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果(n，%)

樣本類型采集標(biāo)本數(shù)陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)病原型別

HEV-71CV-A16其他腸道病毒

便321279(86.9)124(44.4)72(25.8)83(29.7)

咽拭60000

3 討論

手足口病是一種全球性的腸道傳染性疾病，從1981年上海首次報(bào)道本病以來，在我國(guó)流行呈上升趨勢(shì)，2008年5月2日手足口病被納入我國(guó)丙類傳染病管理。沈陽(yáng)市從2008年開始監(jiān)測(cè)手足口病，到2012年為止病原型別以HEV-71和CV-A16為主，其中優(yōu)勢(shì)型別均為HEV-71型[4]。2013年共采集了327份HFMD病例標(biāo)本，包括321份糞便標(biāo)本和6份咽拭標(biāo)本，其中咽拭標(biāo)本檢測(cè)均為陰性，糞便標(biāo)本陽(yáng)性率為86.9%，主要型別仍然為HEV-71和CV-A16，優(yōu)勢(shì)型別為HEV-71型。同時(shí)，對(duì)比沈陽(yáng)市近幾年監(jiān)測(cè)結(jié)果，其他腸道病毒所占比率逐年增加，2013年達(dá)到29.7%，說明除HEV-71型和CV-A16型外，引起手足口病暴發(fā)的其他腸道病毒同樣需要關(guān)注[5]。

本文通過對(duì)沈陽(yáng)市2013年監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院收集的HFMD病例糞便標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示主要致病病毒仍為HEV-71型，同時(shí)HEV-71型也是引起手足口重癥病例的主要毒株類型。手足口病易導(dǎo)致托幼機(jī)構(gòu)聚集和暴發(fā)疫情的發(fā)生，托幼機(jī)構(gòu)兒童應(yīng)作為手足口病防控的重點(diǎn)人群。截至目前為止，手足口病還沒有特效的疫苗來預(yù)防，因地制宜的采取一些綜合性防制措施已是控制本病流行的當(dāng)務(wù)之急。

參考文獻(xiàn)：

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[2] Chang LY， Lin TY， Hsu KH， et a1.Clinical features and risk factors of pulmonary oedema after enterovirus-71-related hand， foot， and mouth disease.Lancet， 1999， 354: 1682-1686.

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.手足口病預(yù)防控制指南（2009版）.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.2009.

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[5] 李忠，張華寧，裴耀文。不同分子生物學(xué)方法檢測(cè)手足口病標(biāo)本的應(yīng)用研究。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床。2009，6，：268-269.