種培芳，蘇世平，李毅＊，孫兆成

（1.甘肅農業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州730070；2.武威市石羊河林業(yè)總場小壩口分場，甘肅 武威733300）

紅砂（Reaumuriasoongorica）為超旱生小灌木，廣泛分布于我國干旱荒漠地區(qū)，特別廣布于西北的半干旱地區(qū)，并且是這些自然分布帶的建群種和優(yōu)勢種［1］。其抗逆性強，生態(tài)可塑性大，具有很強的抗旱、耐鹽和集沙能力，對荒漠地區(qū)的生態(tài)保護具有重要作用［2，3］。紅砂幼苗是影響紅砂種群更新的瓶頸之一，而水分是干旱半干旱地區(qū)重要的環(huán)境因子，水分變化將通過影響紅砂幼苗進而影響其種群動態(tài)。迄今關于紅砂抗旱性的研究已有若干報道［4－9］，不僅有對紅砂這一樹種的單獨研究，亦有與其他抗旱樹種［如珍珠（Salsolapasserina）、霸王（Zygophyllumxanthoxylum）等］的比較研究。但對不同紅砂種源抗旱性的比較研究至今鮮有報道。

實驗室內人工模擬的干旱條件，適于對林木大批量材料進行苗期抗旱鑒定，具有方法簡單、重復性好等特點。對林木抗旱性鑒定多采用高滲溶液模擬水分脅迫的方法，目前很多研究者應用聚乙二醇（PEG）作為誘導劑和篩選劑［10，11］。聚乙二醇（PEG）是一種大分子聚合物，能夠奪取水分對植物造成滲透脅迫，在PEG滲透脅迫下，勢必引起植物體內一系列的生理生化反應［12］。而同一植物長期生長在異質環(huán)境條件下，經過自然選擇和適應，會在形態(tài)和生理特性等方面產生變異，形成特定的地理種源［13］。不同紅砂種源在長期的生長過程中也已形成了自己的生態(tài)適應性及生產力等方面的遺傳差異?；谶@樣的理論，本研究利用不同濃度的PEG－6000溶液對4個紅砂種源幼苗進行不同濃度、不同時間PEG的滲透脅迫處理，研究紅砂幼苗生理指標的變化，旨在了解紅砂對PEG脅迫生理響應的種源差異，區(qū)分其環(huán)境效應和遺傳效應，為紅砂種源選擇、雜交育種，干旱條件下紅砂的培育及遺傳資源保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以蘭州、武威、張掖和酒泉紅砂幼苗為材料，種子均是2008年8月底在各地采集的。各采種地水熱條件列于表1中。

表1 紅砂各種源地的地理和氣候條件Table 1 Original geographical and climatic conditions of the four provenances of R.soongorica

1.2 幼苗的培養(yǎng)

種源育苗試驗點在武威市林木種苗繁育中心的溫室內。該中心位于103.16°E、38.41°N，年均溫7.8℃，7月均溫23℃，1月均溫－10℃，年均降水量190mm；溫室內采用25℃恒溫，75%濕度，于2009年3月上旬播種，播種前用0.5%的高錳酸鉀溶液消毒20min左右，清水沖洗，再用30℃的溫水浸種24h，然后播種于培養(yǎng)穴中，基質成分為沙土10%～20%，沙壤土60%～80%，腐熟羊糞10%～20%。播種后定時定量澆水（由供液系統(tǒng)每天早晨噴霧0.5h），自然光照。待幼苗苗齡3個月，苗高15cm左右時，選取生長一致的幼苗，洗凈根系上的泥土，吸干根系上的水分，每個種源紅砂取150顆幼苗，平均取30顆放入濃度梯度為0（CK），5%，10%，15%，20%的PEG－6000培養(yǎng)液進行滲透脅迫處理。各濃度分別于處理12，24，48和72h后摘取葉片進行各項生理指標測定。

1.3 相關指標測定方法

脯氨酸（proline，Pro）含量采用茚三酮比色法［14］測定；可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮比色法測定［15］；丙二醛（malondiadehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定［14］；超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）活性采用氮藍四唑法測定［14］；過氧化物酶（peroxide enzyme，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定［14］；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法測定，質膜透性（relative permeability of plasma，RPP）采用電導儀測定［16］。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 13.0完成，多重比較分析采用Duncan法，圖片采用Excel 2003完成。

2 結果與分析

2.1 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗滲透調節(jié)物質的影響

結果表明（圖1）：在不同質量分數(shù)和不同時間PEG溶液處理下，紅砂葉片脯氨酸（Pro）和可溶性糖（SS）含量均顯著高于對照。在脅迫初期（12～24h）Pro和SS含量均有所增加，隨著時間的延長（48h），Pro含量增加趨勢仍較明顯（圖1A），但SS含量增加幅度減緩并呈現(xiàn)下降趨勢（圖1B）。2個指標隨處理濃度的增加均呈先高后低的趨勢。蘭州、武威、張掖和酒泉4個種源紅砂幼苗的Pro含量在脅迫72h和15%脅迫處理下達到最大值，分別是CK的4.57，7.95，4.60和5.89倍，相同脅迫下，武威紅砂幼苗的Pro含量增幅最大，酒泉第2，張掖次之，蘭州最小。蘭州、武威、張掖和酒泉4個種源紅砂幼苗的SS含量在48h和15%脅迫處理下達最大，分別是CK的5.35，7.05，5.86和7.10倍。相同脅迫下，酒泉紅砂幼苗SS含量增加幅度最大，武威第2，張掖次之，蘭州最小。均在脅迫72h時和20%濃度達到了最大值，分別是CK的6.33，3.43，3.62和4.81倍。相同脅迫下，武威沙拐棗幼苗的MDA含量增加幅度最小，張掖第2，酒泉次之，蘭州增加幅度最大。

2.2 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗丙二醛含量的影響

4個地理種源紅砂幼苗葉片丙二醛（MDA）含量在PEG脅迫下均有顯著升高（圖2），且均在脅迫72h時和20%濃度達到了最大值，分別是CK的6.33，3.43，3.62和4.81倍。相同脅迫下，武威沙拐棗幼苗的 MDA含量增加幅度最小，張掖第2，酒泉次之，蘭州增加幅度最大。

圖1 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig.1 Effect of osmotic stress with PEG on proline and soluble sugar content of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

2.3 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗活性氧清除酶的影響

4個不同地理種源紅砂幼苗葉片的SOD、POD和CAT活性隨脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢（圖3，4，5），這是其對脅迫時間的適應性表現(xiàn)。除蘭州紅砂幼苗的SOD和CAT在10%PEG脅迫下活性達到峰值外，其余均在15%PEG處理下活性達到峰值（圖3，5）。但各種源達到最大峰值的處理時間卻不一樣，武威、張掖和酒泉紅砂的SOD均是15%處理48h時達最大，分別是CK的4.05，2.98和3.18倍。而蘭州紅砂則是10%PEG處理48h時達到最大值，是CK的2.78倍。4個地理種源紅砂的POD值均是15%PEG處理48h時達最大（圖4），分別是CK的12.54，27.76，13.73和15.09倍。4個地理種源紅砂的CAT均是15%PEG處理48h時值最大，分別是CK的7.45，18.36，8.34和13.58倍。

圖2 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of osmotic stress with PEG on MDA content of R.soongoricaseedlings in different geographical provenance

2.4 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗葉片相對質膜透性的影響

隨著干旱脅迫時間的延長4個地理種源紅砂幼苗的細胞膜透性與對照相比均有所上升（圖6），說明在干旱脅迫下，4個地理種源紅砂幼苗的細胞膜都受到了一定的傷害，但受害程度種源間存在差異。蘭州種源從干旱脅迫開始膜透性就有較大的增幅，重度干旱脅迫（20%和72h）下增幅達到了最高值，是CK的3.5倍。武威種源的膜透性增幅最小，重度干旱脅迫（20%和72h）下僅為CK時的2.1倍。張掖和酒泉種源的膜透性增幅介于兩者之間。

2.5 干旱脅迫下紅砂種源生理指標的方差分析和相關性分析

4個種源紅砂的MDA，Pro，SS，SOD，CAT，POD，RPP等7個指標在10%、15%及20%PEG與5%PEG及對照間差異顯著（P＜0.05）（表2）。在處理時間上48和72h與其他2個處理間差異顯著（P＜0.05）。在種源間每個指標的差異性不同，比如Pro在武威和酒泉無顯著差異，而MDA在這2個種源間差異顯著（P＜0.05）。這些結果說明，不同種源紅砂幼苗對不同PEG脅迫的生理適應，不隨濃度和脅迫時間變化的格局存在差異。

通過分析PEG脅迫下紅砂生理指標的相關性發(fā)現(xiàn)，4個地理種源紅砂的MDA含量與膜透性之間呈一定的正相關，即在干旱脅迫下細胞質膜透性增加的同時，MDA含量也同時增加。4個地理種源的游離Pro和可溶性糖均與細胞膜透性呈極顯著正相關（P＜0.01）。4個地理種源紅砂的CAT活性與膜透性均呈極顯著負相關（P＜0.01），SOD、POD活性與膜透性呈顯著（P＜0.05）或極顯著負相關（P＜0.01）（表3）。

2.6 4個地理種源紅砂幼苗抗旱性的隸屬函數(shù)值分析

對4個不同地理種源紅砂的7個理化指標的抗旱系數(shù)進行隸屬函數(shù)分析，并求其平均值，以評價其抗旱強弱。根據(jù)隸屬函數(shù)平均值的大小對4個不同地理種源紅砂的抗旱性進行排序（表4），抗旱性由強到弱的順序為：武威＞酒泉＞張掖＞蘭州。

圖3 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗SOD活性的影響Fig.3 Effect of osmotic stress with PEG on SOD activities of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

圖4 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗POD活性的影響Fig.4 Effect of osmotic stress with PEG on POD activities of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

圖5 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗CAT活性的影響Fig.5 Effect of osmotic stress with PEG on CAT activities of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

圖6 PEG脅迫對不同地理種源紅砂幼苗質膜透性的影響Fig.6 Effect of osmotic stress with PEG on relative electrical conductivity of R.soongorica seedlings in different geographical provenance

表2 5個PEG濃度、4個脅迫時間和4個種源紅砂生理指標方差分析中的Duncan多重比較檢驗Table 2 Duncan multiple range test of ANOVA for five PEG concentration，four stress time and four provenances of R.soongorica

表3 PEG滲透脅迫下4個地理種源紅砂7個生理指標之間的相關分析Table 3 Correlation analysis of seven physiology index of R.soongoricain four of geographic provenances under PEG

3 討論與結論

3.1 不同地理種源紅砂對滲透脅迫的反應

眾多研究表明，SOD對植物抗旱性起著關鍵作用［17］，但不同研究材料的SOD活性在干旱脅迫下的變化趨勢不盡相同［18，19］。本研究結果表明，4個種源紅砂幼苗的SOD活性變化趨勢基本一致，均為隨PEG濃度的升高而呈先升高后降低的趨勢，但又隨脅迫時間的延長而呈升高趨勢，說明干旱脅迫下SOD對不同種源紅砂幼苗的保護機制與其脅迫濃度和脅迫時間有關（表2）。研究發(fā)現(xiàn)，POD和CAT在清除紅砂積累的活性氧方面同樣起著重要作用。4個種源中武威種源雖然始終保持較高的POD和CAT活性，但其他每個種源在干旱脅迫期間也都出現(xiàn)了峰值，說明脅迫狀態(tài)下紅砂體內POD和CAT保護酶對體內活性氧的清除能力有一個閾值，在此閾值之內，植株能夠提高其體內保護酶活性，加大對活性氧的清除力度，超過此閾值，則保護酶活性下降。許多研究表明MDA含量的增加與電解質外滲率的增大呈正相關［16］，即認為膜質過氧化過程是造成膜結構與功能破壞的重要因素。本研究結果顯示，在重度脅迫下（15%和48h以后），4個種源紅砂的MDA含量和質膜透性急劇升高，這一結果與前人的結論一致。就種源間比較而言，武威種源紅砂在水分干旱脅迫下的MDA含量始終處于較低水平，其質膜受到的傷害最小，即武威種源紅砂抵御干旱的能力較其他3個種源強。這可能是由于其體內的SOD、POD及CAT等酶能夠保持較高的活性，從而清除干旱脅迫下產生的自由基。通過相關性分析可以發(fā)現(xiàn)，對于4個地理種源的紅砂來說其游離Pro與膜透性呈極顯著正相關，表明游離Pro是紅砂的有效調節(jié)成分，但調節(jié)能力在種源間產生差異，其相關系數(shù)分別為0.906，0.985，0.994，0.975；4個地理種源紅砂的膜透性雖然與可溶性糖呈正相關，但蘭州種源并沒有達到顯著，所以對于蘭州種源紅砂可溶性糖也不是其主要調節(jié)物質。盡管滲透調節(jié)對植物適應干旱脅迫起到了很重要的作用，但是滲透調節(jié)有其所發(fā)生的條件。一般來說滲透調節(jié)發(fā)生在中度水平逆境下，并且其調節(jié)范圍也有一定的限度［20］。分析可以發(fā)現(xiàn)，在重度干旱脅迫的情況下，紅砂體內的滲透調節(jié)物質也呈現(xiàn)一定下降的趨勢，抗旱性弱的種源較抗旱性強的種源呈現(xiàn)出較早的下降趨勢。這一結果和曹儀植［21］在小麥（Triticumaestivum）上的研究結論一致。

表4 4個地理種源紅砂的抗旱能力綜合評價Table 4 Comprehensive appraisal of drought resistance of R.soongoricain four geographic provenances

3.2 不同地理種源紅砂幼苗抗旱能力的綜合評價

植物整體抗旱性的評價不同于一般抗旱性評價，必須綜合考慮植物不同生活史階段、不同層次的抗旱性指標的貢獻大小，同時根據(jù)各項指標反映的抗旱性信息大小來進行評價［22］。本研究在不同濃度和時間的PEG干旱脅迫處理后對不同紅砂種源的抗旱性指標進行綜合分析，無論從濃度、時間還是種源水平上任何一個指標來評價紅砂的抗旱性所得的結果均不盡相同（表2），而且各指標之間關系復雜，不同指標的重要性也不相同，所以需對其進行綜合分析。隸屬函數(shù)分析提供了一條在多指標測定基礎上對紅砂苗木抗旱性進行綜合評價的途徑，避免了單一指標的片面性［23］。紅砂是旱生植物，所以，總體上它是一個很抗旱的種，但因種內遺傳漂移、突變、遷移等因素的影響最終會形成形態(tài)、生理各異的不同種源和地理小種，而種源內部應該存在著抗旱性差異。根據(jù)紅砂生長生境的水分條件可以推斷酒泉種源因長期適應降水少、蒸發(fā)強烈和土壤干旱的環(huán)境而對滲透脅迫的適應性要比武威、張掖及蘭州種源的強。但結果表明，4個種源紅砂的抗旱能力依次為：武威＞酒泉＞張掖＞蘭州。這一結果與曾研究的自然條件下這4個地理種群紅砂抗旱性的結論是一致的［24］。究其原因可能是樣地選擇在鴛鴦池水庫旁邊，空氣濕度高于其他樣地，又或者是樣地的地下水位較高等原因。對種源的抗旱性研究結果證實了這2種推測是合理的。這一結論同時也說明，影響植物抗旱性的水分因素很多，單純根據(jù)部分水分狀況來推測植物的抗旱性會存在一定的誤差。因此，建議在研究植物抗旱性時一定要充分考慮各種水分條件。

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