■崔 培 陳成勛 王慶奎 邢克智 趙海運

(天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點實驗室，天津農(nóng)學院水產(chǎn)科學系，天津 300384)

點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)隸屬于鱸形目、鮨科、石斑魚亞科、石斑魚屬，其肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，享有上等佳肴之美譽，是東南亞沿海重要的高檔海水養(yǎng)殖魚類之一。近年來，點帶石斑魚高密度養(yǎng)殖在我國福建、廣東、廣西和海南沿海地區(qū)發(fā)展迅速。但隨著集約化、設施化高密度養(yǎng)殖模式的擴大，加上配合飼料質(zhì)量不均衡，導致養(yǎng)殖環(huán)境惡化，自身健康狀況下降等一系列問題的出現(xiàn)，在養(yǎng)殖過程中爆發(fā)大規(guī)模的疾病[1-3]，給養(yǎng)殖戶帶來相當大的經(jīng)濟損失。因此迫切需要尋找能夠提高點帶石斑魚非特異性免疫力和抗病力的免疫增強劑。

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fiseh)，又名甜草根、甜甘草、甜根子、粉草等，為豆科(Legum inosae)甘草屬(Glycyrrhiza)多年生宿根草本植物，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中被稱為“百草之王”。其性平味甘，在臨床上具有抗病毒、抗細菌、抗氧化、抗衰老、增效解毒，增強巨噬細胞吞噬能力等作用[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，甘草可提高肉雞的進食欲望，降低能耗，還可促進山羊T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，從而增強其細胞免疫功能[6]。王文博等[7]也發(fā)現(xiàn)甘草粗提物對鯽免疫功能有良好的調(diào)節(jié)作用。但有關甘草甜素對點帶石斑魚免疫功能的影響尚未見報道，因此，本試驗在飼料中添加不同水平的甘草甜素，研究其對點帶石斑魚非特異性免疫的影響，為石斑魚工廠化健康養(yǎng)殖以及為甘草甜素在水產(chǎn)飼料中的應用提供一些參考。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

試驗用點帶石斑魚[(84.11±0.50)g]由天津市海發(fā)珍品實業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗設計和日常管理

基礎飼料中分別添加0、50、200、350、500 mg/kg甘草甜素，制成5種試驗飼料?；A飼料配方見表1，復合維生素和復合礦物質(zhì)按暖水性魚類的營養(yǎng)需求添加[8]。試驗分為5組，每組3個重復，每個重復飼喂2箱，共30箱，每箱30尾。每7 d取樣1次，每次取3箱，每箱15尾，測定血液中的非特異性免疫指標。

表1 基礎飼料原料組成（%）

試驗用水經(jīng)生物包處理、充純氧，并經(jīng)紫外線消毒后使用，采用循環(huán)流水，24 h充氣。飼養(yǎng)期間，水溫保持在26～28 ℃，鹽度28～30，溶解氧5.6～6.5 mg/l，NH4+-N 1.00～1.50 mg/l，NO2--N 0.15～0.40 mg/l。每天換水3次，換水時清除糞便。每天喂食2次（早8:30，晚4:00），每次飽食投喂。

1.3 測定指標及測定方法

試驗魚用MS-222麻醉后，尾柄采血，離心(5 000 r/min、10 min、4 ℃)，-80 ℃保存，測定血清溶菌酶(LZM)活力、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活力，總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量，補體C3和C4含量。另一部分用5%肝素鈉抗凝，計數(shù)血液中的白細胞數(shù)。

ACP、AKP、TP和ALB用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，補體C3和C4用浙江伊利康生物技術有限公司生產(chǎn)的試劑盒進行測定。白蛋白/球蛋白（A/G）=A/(TP-A)[9]。

1.3.1 溶菌酶（LZM）活力的測定

將活化后的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)用 PBS(pH 值 6.4)將濃度調(diào)至 OD570≈0.3，取150 μl菌懸液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)基上等間距放置直徑4.32 mm的滅菌濾紙片，向濾紙片中心滴加濃度分別為375、750、1 125、1 500、1 875、2 250 U/ml的溶菌酶標準品溶液10 μl，28℃于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑為橫坐標(X)，溶菌酶標準品濃度的對數(shù)為縱坐標(Y)得到回歸方程。取10 μl血清加在濾紙片上，按上述方法孵育，測量抑菌圈直徑。將抑菌圈直徑代入回歸方程，計算出血清中溶菌酶活力。

1.3.2 血液白細胞計數(shù)

血液用白細胞稀釋液稀釋100倍。白細胞稀釋液配制如下：98 ml蒸餾水加入1%亞甲藍3滴，冰醋酸2 ml，配制成100 ml白細胞稀釋液。血液白細胞數(shù)（個/l）=5個大方格中白細胞數(shù)×50 000×1 000×稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)用EXCEL軟件計算平均值和標準差，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。采用SPSS13.0進行相關性檢驗，單因素方差分析檢驗試驗組間顯著性，若組間差異顯著(P＜0.05)，則作Duncan’s法多重比較分析。

2 結果

2.1 溶菌酶（LZM）的活力（見表2）

表2 點帶石斑魚血清LZM活力（U/g prot.）

由表2可知，第7 d時，各試驗組的LZM活力均高于0 mg/kg組，其中，350 mg/kg組和500 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，14 d時50 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，而第21、28 d各試驗組與0 mg/kg組間均無顯著差異。

2.2 血清酸性磷酸酶（ACP）活力

表3 點帶石斑魚血清ACP活力（U/100 ml）

甘草甜素對點帶石斑魚血清ACP的影響見表3。在第7 d時，除50 mg/kg組外，其他各組均顯著高于0 mg/kg組；第14 d時，350 mg/kg組和500 mg/kg組顯著低于0 mg/kg組。

2.3 血清堿性磷酸酶（AKP）活力

甘草甜素對點帶石斑魚血清AKP的影響見表4。在第7、21 d以及28 d時，各試驗組AKP活力與0 mg/kg組相比，均無顯著差異；第14 d時，各試驗組AKP活力均低于0 mg/kg組，其中，500 mg/kg組顯著低于0 mg/kg組。

表4 點帶石斑魚血清AKP活力（U/100 ml）

2.4 補體C3和C4的活力

甘草甜素對點帶石斑魚血清補體C3的影響見表5。第7 d時，各試驗組的補體C3含量均高于0 mg/kg組，其中，500 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，第14、21、28 d時，各試驗組補體C3含量均與0 mg/kg組無顯著差異（P＞0.05）。

表5 點帶石斑魚血清補體C3含量（g/l）

甘草甜素對點帶石斑魚血清補體C4的影響見表6。第7 d時，各試驗組補體C4活性均高于0 mg/kg組，且350 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組；第14 d時，350 mg/kg組和500 mg/kg組顯著低于0 mg/kg組；第21 d和28 d，各試驗組與0 mg/kg組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

表6 點帶石斑魚血清補體C4含量（g/l）

2.5 白蛋白/球白蛋比值

甘草甜素對點帶石斑魚血清A/G比值見表7。第7 d時，各試驗組的A/G比值均顯著低于0 mg/kg組(P＜0.05)；第14、21 d時，各試驗組的白蛋白/球蛋白比值與0 mg/kg組相比均無顯著差異(P＞0.05)；第28 d時，200 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組(P＜0.05)。

2.6 白細胞數(shù)目

甘草甜素對點帶石斑魚血液中白細胞數(shù)目的影響見表8。第7 d時50 mg/kg組和350 mg/kg組白細胞數(shù)目均顯著高于0 mg/kg組（P＜0.05）；第14、21、28 d時，各試驗組白細胞數(shù)目與0 mg/kg組相比無顯著差異（P＞0.05）。

表7 點帶石斑魚血清白蛋白/球蛋白(A/G)比值（mg/ml）

表8 點帶石斑魚血液白細胞數(shù)目（×1011個/l）

3 討論與小結

LZM是一種體液免疫指標，它是機體受到外界刺激的一項基本防御機制，廣泛存在于生物體液、血清和巨噬細胞中，在動物免疫防御中發(fā)揮重要作用，其活性高低是決定吞噬細胞能否殺滅所吞噬致病菌的物質(zhì)基礎之一[10-13]。陳超然等[14]對中華鱉的研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加15、25、35、45、55 mg/kg的甘草素對其血清LZM活性沒有顯著影響。楊興斌等[15]用3種不同分子量大小的當歸多糖體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞48 h后發(fā)現(xiàn)當歸多糖能顯著提高巨噬細胞LZM活力。王慶奎等[16]對點帶石斑魚的研究發(fā)現(xiàn)，喂食當歸多糖350、500 mg/kg組7 d后能顯著提高點帶石斑魚血漿LZM活力，而14～28 d內(nèi)LZM活力與0 mg/kg組無顯著差異。本試驗中，第7 d時，各試驗組的LZM活力均高于0 mg/kg組，其中，350 mg/kg組和500 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，第14 d時，50 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，其他各組以及第21 d、28 d各試驗組與0 mg/kg組相比均無顯著差異。說明投喂高劑量(350、500 mg/kg組)的甘草甜素能在短時間(7 d)內(nèi)提高點帶石斑魚血清LZM活力，投喂50 mg/kg的甘草甜素14 d也可顯著提高LZM活力，但隨著喂食時間的延長LZM活力恢復至0 mg/kg組水平。

酸性磷酸酶（ACP）是巨噬細胞溶酶體的標志酶，與機體物質(zhì)代謝關系密切，它通過催化磷蛋白中磷酯鍵的水解，直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝，在體內(nèi)細胞調(diào)節(jié)過程中起重要作用。周進等[17]發(fā)現(xiàn)，投喂含A3α肽聚糖的飼料40 d后，可以顯著提高牙鲆（Paralichthys olivaceus）肝臟中ACP活力。牟海津等[18]對櫛孔扇貝的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蟲草多糖和海藻多糖注射刺激后，櫛孔扇貝血清中ACP活性增強。吳桂玲[19]在飼料中添加100 mg/kg和500 mg/kg A3α肽聚糖喂食花鱸(Lateolabrax japonicus)，結果發(fā)現(xiàn)，42 d后花鱸肝臟ACP活力與0 mg/kg組無顯著差異，而喂食84 d后兩組的ACP活力均顯著低于0 mg/kg組，并認為這是由于出現(xiàn)免疫疲勞所致。本試驗中，投喂第7 d時，除50 mg/kg組外，其他各組均顯著高于0 mg/kg組。

堿性磷酸酶(AKP)廣泛存在于微生物和動物界，能催化所有的磷酸單脂的水解反應及磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應，AKP活性與動物的生長呈正相關，在一定程度上反映動物的生長速度[20]?？潞频萚21]試驗發(fā)現(xiàn)，投喂中草藥2號的鮑中AKP酶活力極顯著高于對照。本試驗中，在第7、21 d以及28 d時，各試驗組AKP活力與0 mg/kg組相比，均無顯著差異，第14 d時，各試驗組AKP活力均低于0 mg/kg組，其中，500 mg/kg組顯著低于0 mg/kg組。

硬骨魚類的補體系統(tǒng)在防御細菌、病毒、真菌和寄生蟲侵襲過程中具有重要作用，也可介導免疫病理的損傷性反應，是機體內(nèi)具有重要生物學意義的效應系統(tǒng)和效應放大系統(tǒng)[22]。補體C3是補體系統(tǒng)中含量最多、最重要的一個組分，它是補體兩條主要激活途徑的中心環(huán)節(jié)，被激活后裂解為C3a和C3b。C3a參與具有C3a受體的白細胞結合，在炎癥反應中起關鍵作用。補體C4是補體經(jīng)典激活途徑的一個重要組分，是補體活化的經(jīng)典途徑和MBL途徑的必要成分，裂解產(chǎn)物C4b參與C3的裂解及后續(xù)的補體反應[23]。研究發(fā)現(xiàn)：在飼料中添加適量免疫多糖（酵母細胞壁）可以增強中華鱉中補體C3和C4的活性，但添加過量后則會抑制補體C3和C4活性。本試驗中，投喂甘草甜素7 d可提高補體C3和C4含量，且500 mg/kg組的補體C3含量顯著高于0 mg/kg組，350 mg/kg組的補體C4含量顯著高于0 mg/kg組。

A/G值是反映魚類非特異性免疫力的重要指標，A/G值越低說明免疫球蛋白含量越高，免疫力越高[9]。本研究發(fā)現(xiàn)喂食甘草甜素7 d能顯著降低A/G值。

在魚類血細胞中,吞噬細胞、中性粒細胞、巨噬細胞都具有吞噬異物的能力，是魚類非特異性免疫的主要指標之一，它們的數(shù)量和吞噬能力的高低可直接反映出魚類非特異性免疫能力的大小，在魚類的非特異性免疫中起著至關重要的作用。本試驗中，第7 d時添加甘草甜素50、350 mg/kg組白細胞數(shù)目明顯增多。

投喂350 mg/kg組和500 mg/kg組的甘草甜素7 d可以顯著提高點帶石斑魚血清LZM、ACP活力，顯著降低A/G值，投喂500 mg/kg組的甘草甜素7 d可以顯著提高血清補體C3含量，投喂350 mg/kg組的甘草甜素7 d可以顯著提高血清補體C4含量，增加白細胞數(shù)目。因此，建議飼料中添加量為350 mg/kg，連續(xù)喂食7 d。