趙曉麗 周 琦 張 凱 鄧叢良*

（北京出入境檢驗檢疫局 北京 101312）

1 前言

磁性納米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）是指含有磁性金屬或金屬氧化物的超細(xì)粉末且具有磁響應(yīng)性的納米級粒子，具有獨特的超順磁性能[1]。由于其比表面積大、表面活性中心多、表面反應(yīng)活性高、吸附能力強(qiáng)、催化能力高、毒性低且不易受體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)各種酶降解等特點，在多個領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

磁性納米粒子的種類很多，較常用的有金屬合金、氧化鐵、鐵氧體、氧化鉻等，其中氧化鐵（γ-Fe203、Fe304）磁性材料應(yīng)用最多[2]。磁性納米粒子通過表面共聚和表面改性的方法，能與有機(jī)物或高分子聚合物或無機(jī)材料相結(jié)合形成核殼結(jié)構(gòu)的磁性復(fù)合粒子，既具有磁性，又具有表面活性基團(tuán)，能進(jìn)一步和細(xì)胞、酶、蛋白質(zhì)、抗體及核酸等多種生物分子偶聯(lián)。在外加磁場的作用下，磁性粒子能夠很方便地和底液分離，具有操作簡便和分離效率高的優(yōu)點。此外，磁性納米粒子具有大的比表面積，為修飾多種高密度分子探針提供了基礎(chǔ)，在細(xì)胞分離、蛋白質(zhì)純化及DNA分離檢測等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景[3-6]。

2 基于磁分離技術(shù)的檢測技術(shù)

磁性分離技術(shù)（Magnetic Separation, MS）是依據(jù)物質(zhì)的磁性差異，在磁場作用力的驅(qū)動下，把磁性組分從非磁性組分混合物中分離出來的一種分離技術(shù)。傳統(tǒng)的磁性分離理論方法已經(jīng)在許多工業(yè)過程中獲得了應(yīng)用，如冶金工業(yè)中的礦物磁選分離。由于生物體系中的絕大多數(shù)生物分子都無磁性，為了給欲分離的目標(biāo)生物分子賦予磁性，需要預(yù)先制備一種磁性載體顆粒作為運(yùn)載工具，借助于磁性分離裝置，對目標(biāo)生物分子進(jìn)行負(fù)載、運(yùn)載和卸載等分離操作，從而實現(xiàn)目標(biāo)生物分子的磁性分離過程。

磁性分離技術(shù)因其具有快速、簡便、靈敏等特點，近年已被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷、食品安全快速檢測、環(huán)境檢測和植物病毒檢測的研究中[7-8]。磁分離技術(shù)可以直接應(yīng)用于目標(biāo)物質(zhì)的檢測，也可以和現(xiàn)有的其他生物技術(shù)，如分子生物學(xué)檢測技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)、熒光檢測技術(shù)等相結(jié)合，從而實現(xiàn)更為有效簡便的快速檢測[9]。

免疫磁性分離技術(shù)（Immunomagnetic beadbased separation, IMS）是目前應(yīng)用最廣泛的磁分離技術(shù)，它整合了免疫反應(yīng)的高度特異性和磁性分離快速、簡單的優(yōu)點。

2.1 磁分離-PCR檢測技術(shù)

傳統(tǒng)的PCR檢測技術(shù)雖然靈敏度高，但是因為其所使用的樣本往往是活菌和死菌的混合體，因此假陽性反應(yīng)較高。利用磁分離技術(shù)先分離或富集目標(biāo)生物分子，然后再結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)的指紋基因進(jìn)行檢測，可以減少培養(yǎng)基質(zhì)的影響，提高檢測的速度和靈敏度。

2.2 磁分離-ELISA檢測技術(shù)

普通的ELISA技術(shù)采用的酶標(biāo)板是一個固相載體，具有固/液相反應(yīng)接觸面積小，聯(lián)接的抗體易脫落，反應(yīng)速度慢且不徹底等缺點。磁分離-ELISA技術(shù)(MS-ELISA)是一種以磁性納米材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)ELISA中的酶標(biāo)板，將ELISA的顯色系統(tǒng)與磁分離技術(shù)相結(jié)合而形成的一種新型檢測方法。利用納米材料的高比表面積、易于形成膠體溶液等特性，MS-ELISA法中的抗原-抗體分子接觸面積變大，反應(yīng)較為徹底，此外磁分離使緩沖液的交換操作更為簡便快速，靈敏度也得到了提高[10-12]。

2.3 磁分離熒光分析檢測技術(shù)

熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、操作簡便等優(yōu)點。磁分離熒光分析技術(shù)是一種將磁分離技術(shù)與熒光分析相結(jié)合的技術(shù)，通常先以磁分離選擇目標(biāo)物質(zhì)，再利用熒光物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測。

3 磁分離技術(shù)在檢測中的應(yīng)用

基于磁性納米粒子的磁分離技術(shù)在生物分子檢測中的應(yīng)用一直是生物分析化學(xué)領(lǐng)域研究的熱點問題之一，利用磁性納米粒子特殊的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子效應(yīng)等可以在生物分子檢測中明顯地提高分析與檢測的靈敏度和選擇性，因此在多個領(lǐng)域有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 磁分離技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢測中的應(yīng)用

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為了分析檢測或其他應(yīng)用，通常需要將被研究的生物實體與其所在的環(huán)境分離。應(yīng)用具有生物相容性的磁性納米粒子的磁分離技術(shù)是達(dá)到該要求的一種方法。

癌癥是目前較難醫(yī)治的疾病之一，但大量臨床事實證明，癌變初期的治愈率相當(dāng)高，因此治療癌癥的關(guān)鍵在于有效地早期診治。目前確診癌癥最有效的手段是病理診斷，但準(zhǔn)確性往往受限于操作醫(yī)生的工作經(jīng)驗，早期病變?nèi)菀茁┰\、誤診。將納米分離技術(shù)與生化檢測技術(shù)相結(jié)合，能夠?qū)Π┌Y進(jìn)行早期診斷[13，14]，是及早預(yù)防和診治癌癥的重要方向，為臨床上癌癥的早期、準(zhǔn)確診斷提供了良好的方法和依據(jù)。

納米免疫磁粒子在磁場作用下具有高的特異性、濃縮性和可分離性，可以對外周血中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集、濃縮與分離，有助于癌細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。Taubert等[15]已用白細(xì)胞分化抗原（CD）45單抗標(biāo)記免疫磁性微球?qū)⑼鈬械陌准?xì)胞去除，從而實現(xiàn)癌細(xì)胞的富集，隨后用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測乳腺癌細(xì)胞。Nam等[16]用標(biāo)記有前列腺特異性抗原（PSA）單抗的磁性微球，通過夾心法與血清中的PSA形成復(fù)合物，在磁場下分離血清中的PSA，然后用PCR或基因芯片技術(shù)檢測，其靈敏度比常規(guī)的臨床檢測方法高6個數(shù)量級。Nakamura等[17]應(yīng)用包被Ber-EP4的免疫磁粒子富集外周血中單核細(xì)胞，然后用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測食道癌細(xì)胞。目前，該技術(shù)還用于肺癌[18]、胃癌[19]、肝癌[20-21]和鼻咽癌[22]患者外周血中癌細(xì)胞的檢測。

乙型肝炎是一種傳染性疾病，只有早期診斷才能盡早隔離，從而控制其傳播。張寶亮等[23]通過化學(xué)鍵連接的方法制備出表面偶聯(lián)乙肝抗體的磁性復(fù)合微球，采用類“雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法”對乙肝抗體的活性及優(yōu)化效果進(jìn)行了檢測。通過性能檢測比較，磁分離技術(shù)法檢測靈敏度高于普通酶聯(lián)免疫法。李成德等[24]通過實驗得出結(jié)論：磁分離技術(shù)在HBV檢測中的應(yīng)用對乙型肝炎患者的臨床診斷和療效監(jiān)測將有十分重要的意義。

另外，Van Helden等[25]將抗體連接的納米磁性微球與高效率、快速的化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)相結(jié)合的自動檢測系統(tǒng)，成功地用于血清中人免疫缺陷病毒1型和2型（HIV-1和HIV-2）抗體檢測。Constanine等[26]通過使用磁分離技術(shù)和免疫PCR技術(shù)檢測HIV病毒的P24蛋白，在每個反應(yīng)中可以檢測到10到100個P24蛋白分子，從而將檢測靈敏度提高到不到一個病毒的檢出能力，所有其他的現(xiàn)有方法中都無法達(dá)到。

3.2 磁分離技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

隨著人們對食品安全的重視，致病微生物的檢測技術(shù)也朝著快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保方向迅速發(fā)展[27]。E.Coli O157∶H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌是引起食物中毒的主要致病菌。目前，免疫磁分離技術(shù)已廣泛應(yīng)用于這4種致病菌的檢測。

Hand ley等[28]使用磁分離技術(shù)與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記ELISA復(fù)合的方式檢測大腸桿菌E.Coli O157∶H7，達(dá)到了7.6×103個活細(xì)胞的下限，更把原來1d甚至數(shù)d的檢測時間縮短到了75min。Notzon等[29]用IMS-熒光PCR技術(shù)相結(jié)合檢測肉類中的沙門氏菌，12-13 h即可完成檢測過程，IMS-熒光PCR在檢測自然感染肉類和人工感染肉類上都具有較高的敏感性和特異性。Hudson 等[30]研究表明，將免疫磁分離技術(shù)與PCR結(jié)合，24 h內(nèi)即可檢出火腿中的單核細(xì)胞增生李斯特菌，檢出低限為11 cfu/g。Alefantis等[31]用特異性多抗包被磁性納米粒子，用熒光染料Alexa fluor 647結(jié)合特異的單抗來檢測金黃色葡萄球菌，整個檢測過程只需40-50 min，靈敏度很高（＜ 100 pg），而且采用此方法不需要二抗，適合于微量樣品的檢測。

另外，免疫磁分離技術(shù)還用于檢測其他致病菌[32-35]及食品樣品中的病毒[36]。

3.3 磁分離技術(shù)在環(huán)境檢測中的應(yīng)用

目前已經(jīng)有報道將免疫磁分離技術(shù)引入環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，用于對環(huán)境中自然水體、生活污水、工業(yè)廢水、土壤環(huán)境中部分細(xì)菌、致病原蟲、病毒和有毒有機(jī)物的檢測。

Lee等[37]采用免疫磁粒子檢測環(huán)境中的大腸桿菌，靈敏度提高到了20 CFV/100 mL，檢測時間則由原來的超過24h縮短到1h。張凡飛等[38-39]采用PCR法、免疫磁分離法和神奈川現(xiàn)象培養(yǎng)基三者結(jié)合的方法成功的從環(huán)境中分離出了用一般細(xì)菌培養(yǎng)分離方法很難分離到的TDH陽性副溶血性弧菌，極大地提高了環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率，也為研究TDH陽性副溶血性弧菌在環(huán)境中的分布及預(yù)防由其引起的食物中毒提供了依據(jù)，該方法對于水和食品中致病微生物的快速分離和檢驗也有著重要的應(yīng)用價值。Islam等[40]采用IMS和PCR檢測糞便中的志賀菌，該方法簡單、快速，檢測所需時間為7h，在糞便樣品中的檢測限為10 cfu/g。李鳳儀等[41]用抗志賀氏菌抗體包被醛基磁性微球，濃集水中的志賀氏菌，然后用 PCR 進(jìn)行檢測，取得了較好的結(jié)果。Hulten等[42]檢測了秘魯飲用水中幽門螺旋菌，該研究用抗幽門螺旋菌IgG包被的免疫磁粒子富集幽門螺旋菌，結(jié)合PCR擴(kuò)增，得出結(jié)果證明，秘魯某些飲用水中存在幽門螺旋菌，與先前流行病研究結(jié)果一致。

1996年，美國環(huán)?？偩珠_始將免疫磁性分離機(jī)技術(shù)應(yīng)用于卵囊和孢囊的檢測過程，這是目前國際上最為常用的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[43]。免疫磁性分離用于多種水域中隱孢子蟲的檢測，并提供了很高的檢測率。囊式過濾器用于免疫磁性分離后成為檢測環(huán)境樣中的隱孢子蟲的最有效的方法[44]。Mahbubani[45]采用免疫磁粒子分離技術(shù)和PCR擴(kuò)增結(jié)合的方法，檢測環(huán)境水中污染賈第鞭毛蟲包囊DNA，研究發(fā)現(xiàn)，免疫磁粒子法分離環(huán)境水及飲用水中賈第鞭毛蟲，并結(jié)合PCR擴(kuò)增目的基因，可提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。

楊萬等[46]建立了一種免疫磁珠分離技術(shù)聯(lián)合實時定量PCR快速定量檢測水中輪狀病毒的方法，通過制備能夠分離水中輪狀病毒的特異免疫磁珠，優(yōu)化分離條件，建立了免疫磁珠分離前處理方法，并與逆轉(zhuǎn)錄、實時定量PCR結(jié)合，成功用于水中輪狀病毒的檢測。

胡寅等[47]通過將通用抗體固化在自行制備的納米磁珠表面，建立了有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留納米磁珠間接競爭ELISA方法。與傳統(tǒng)ELISA檢測相比，納米磁珠免疫檢測方法對多種有機(jī)磷農(nóng)藥具有顯著的識別作用，方法靈敏度大大提高。

3.4 磁分離技術(shù)在植物病毒檢測中的應(yīng)用

植物病毒病害是一類重要植物病害，幾乎在各類作物上都有發(fā)生，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，病毒病在世界各國的危害日趨嚴(yán)重，發(fā)現(xiàn)和報道的種類也日益增多。在重要植物檢疫性病毒檢測技術(shù)方面，我國出入境植物檢疫采用的手段主要包括口岸現(xiàn)場檢疫、生長季隔離檢疫、實驗室常規(guī)檢驗鑒定、指示植物鑒定、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等。當(dāng)前已經(jīng)有不少關(guān)于采用非特異性磁性納米粒子和RT-PCR、實時熒光RT-PCR相結(jié)合技術(shù)檢測植物病毒的研究。

闞春月[48]等以黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGM M V）作為研究對象，將磁性微珠與CGMMV抗血清混合后，制備成包被CGMMV抗體的免疫磁珠分離植物病毒，提取病毒核酸。鄧叢良等以CGMMV[49]、南芥菜花葉病毒（ArMV）[50]、南瓜花葉病毒（Sq M V）[51]、李痘病毒（PPV）[52]等為研究對象，將磁分離技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，首先利用經(jīng)表面修飾特殊基團(tuán)且不包被抗體的非特異性磁性納米粒子隨機(jī)吸附植物樣品中的病毒粒子，然后用RT-PCR或者Realtime-RT-PCR方法檢測病毒粒子，整個檢測過程只需1-2h，檢測靈敏度比傳統(tǒng)Trizol方法提取病毒RNA提高了近10-100倍，減少了有毒有害物質(zhì)的使用和勞動力的投入，有效去除了PCR反應(yīng)抑制劑；與免疫磁分離方法相比省去了抗體的使用，降低了成本，提高了檢測效率，非常適合口岸一線對植物病毒的檢測要求。

4 總結(jié)與展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多學(xué)科交叉的新型檢測技術(shù)也將越來越多。納米技術(shù)作為一門新興學(xué)科被應(yīng)用于多個領(lǐng)域，必將推動科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展。與現(xiàn)有技術(shù)相比，基于納米磁性粒子的各種檢測技術(shù)將極大提高檢測方法的特異性、靈敏度和速度等性能。到目前為止，基于納米磁性粒子的檢測技術(shù)已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境等多個檢測領(lǐng)域。但是此檢測技術(shù)還不完善，還有很多需要改進(jìn)和值得研究的地方，比如：檢測靈敏度的提高、定量檢測的實現(xiàn)、多元檢測等。相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，通過磁性納米粒子建立的各種自動化實驗平臺將在檢測領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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