夏 爽,趙硯彬,楊鳴琦,胡建英*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100；2.北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院,北京 100871)

有機(jī)磷類化合物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被逐漸廣泛應(yīng)用.近年來,隨著一系列低毒有機(jī)磷農(nóng)藥[1-2]、阻燃劑[3]等有機(jī)磷化合物的開發(fā)和市場化,有機(jī)磷類化合物在人類生活以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占的地位越來越重要,其毒性也隨之受到人們的重視.

長久以來,人們對有機(jī)磷化合物毒性的關(guān)注大多只集中在急性神經(jīng)毒性上[4],對其內(nèi)分泌干擾作用如雌激素效應(yīng),則研究甚少.體外實(shí)驗(yàn)表明有機(jī)磷化合物并不能通過結(jié)合雌激素受體而引起雌激素效應(yīng).如Chen等[5]通過MCF-7細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)和雌激素受體體外結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)證明,辛硫磷、馬拉硫磷、樂果和久效磷 4種有機(jī)磷農(nóng)藥并不顯示雌激素效應(yīng); Kojima等[6]也利用體外雌激素受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明久效磷等有機(jī)磷農(nóng)藥不能引起雌激素效應(yīng).近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道了有機(jī)磷類物質(zhì)對腦垂體促性腺激素具有一定的干擾作用.如 Esmail等[7]將二嗪磷暴露雄性小鼠,導(dǎo)致其血清中促黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)含量升高;Joshi 等[8]將雄性大鼠暴露于乙酰甲胺磷,也同樣觀察到血清中LH、FSH含量的上升,顯示有機(jī)磷可影響腦垂體促性腺激素的合成.但是有機(jī)磷類物質(zhì)是否能夠通過對腦垂體促性腺激素的干擾作用產(chǎn)生雌激素效應(yīng)還沒有相關(guān)的報(bào)道.

草甘膦,由于高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸傳導(dǎo)非選擇的特點(diǎn),近年來成為全世界應(yīng)用最廣的有機(jī)磷除草劑[9],具有較高的環(huán)境濃度.Sanchís等[10]在西班牙檢測了 140個(gè)不同地區(qū)地下水樣品中,有 41%檢出了草甘膦,平均濃度為 200ng/L,最高濃 度 為 2.5μg/L;Popp 等[11]調(diào) 查 了 奧 地 利Vorarlberg地區(qū)最主要的河流,草甘膦濃度大約為0.67μg/L;Peruzzo等[12]對阿根廷布宜諾斯艾利斯省某主要農(nóng)產(chǎn)區(qū)河流調(diào)查顯示,草甘膦甚至達(dá)到 0.70mg/L.但是目前對草甘膦毒性的研究集中于急性毒性上,沒有關(guān)于草甘膦內(nèi)分泌干擾作用方面的研究.

本研究以青鳉魚為實(shí)驗(yàn)動物,通過定量 PCR評估了草甘膦對肝臟VTG的潛在誘導(dǎo)作用,并通過分析調(diào)控雌激素合成的一系列腦垂體性腺軸關(guān)鍵基因和肝臟雌激素代謝酶基因的表達(dá)變化對其誘導(dǎo)機(jī)理進(jìn)行了深入的解析.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40wt.%草甘膦異丙胺鹽水溶液,購自 sigma;trizol,購自invirogen;M-MMLV反轉(zhuǎn)錄套裝,購自康維世紀(jì);SYB ?Green PCR Master mix,購自invirogen.

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚飼養(yǎng)

青鳉魚(Orange-Red strain)由本實(shí)驗(yàn)室繁殖并飼養(yǎng),養(yǎng)殖用水為經(jīng)活性碳過濾并曝氣的自來水.水溫控制在(25±1)℃,水硬度(以 CaCO3計(jì))為(81.1±1.2)mg/L, pH 值為 7.9±0.1,溶解氧為(7.8±0.3)mg/L.光周期為 16h： 8h(晝：夜),以豐年蟲(Artemia nauplii)剛孵化出的幼蟲為餌料,每天上午下午各喂食一次,并及時(shí)清除多余餌料和排泄物.

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)

采用剛孵化出 1～3d(1～3dph)的魚苗,進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn).共設(shè)置5個(gè)濃度梯度,每個(gè)梯度的草甘膦異丙胺鹽濃度分別為 0.2,2,20,200,2000μg/L.以經(jīng)活性碳過濾并曝氣的自來水做空白對照.每日全量換水.用超純水稀釋40wt.%草甘膦異丙胺鹽水溶液配制一系列濃度為 0.004,0.04,0.4,4,40μg/μL 的標(biāo)樣,取 200μL 的上述標(biāo)樣到對應(yīng)的4L暴露池中,使暴露池終濃度分別為 0.2,2,20,200,2000μg/L.

暴露持續(xù)5周,在最后1d,每組隨機(jī)取雌雄魚各6條,用冰塊麻醉,然后每條魚分別取肝臟、性腺和腦,做好標(biāo)記,放入液氮中,用來提取總RNA.

1.4 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

采用Trizol試劑分別提取肝臟、腦、性腺組織總RNA,然后對提取的總RNA進(jìn)行DNase I處理和純化.所得總RNA紫外光吸收A260/280大于1.8.采用HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和OligodT15引物合成cDNA第一條鏈.

1.5 熒光定量PCR檢測

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法,用ABI7500型熒光定量 PCR儀進(jìn)行熒光定量 PCR檢測,RPL-7用作內(nèi)參基因校正實(shí)驗(yàn)誤差[13].Primer Premier 5.0(Premier Biosoft)設(shè)計(jì)所測基因的引物序列,設(shè)計(jì)時(shí)盡可能的跨越內(nèi)含子,以降低DNA污染.引物具體序列見表1,由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成.

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primer pairs of SYBR? Green real-time PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

定量 PCR數(shù)據(jù)以 2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量.采用SPSS軟件(Ver 11.5; Chicago, IL,美國)的獨(dú)立樣品t檢驗(yàn),來檢驗(yàn)不同暴露組和對照組的基因表達(dá)差異的顯著性,P＜0.05為差異顯著.每個(gè)基因的不同濃度暴露組的基因表達(dá)量用對照組基因表達(dá)量的倍數(shù)表示.

2 結(jié)果

2.1 肝臟卵黃蛋白原基因表達(dá)變化

圖1 草甘膦暴露對青鳉魚肝臟中卵黃蛋白原(VTG I)表達(dá)量的影響Fig.1 Vitellogenin gene expression in liver of medaka exposed to glyphosate

在雌性幼魚中,草甘膦在低濃度下(0.2μg/L)即可顯著誘導(dǎo)雌魚卵黃蛋白原基因表達(dá) (P＜0.05),但是隨著暴露濃度的增加,VTG I的表達(dá)量逐漸降低,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系.隨著暴露濃度的升高,VTG各濃度組基因表達(dá)量分別為對照組的101.36、41.76、11.92、5.26、5.34倍(圖1a).在高濃度組(200,2000μg/L),和對照比VTG I基因表達(dá)雖仍有所增加,但并不顯著.在雄魚中,草甘膦對VTG I基因表達(dá)誘導(dǎo)呈現(xiàn)先升后降的趨勢：濃度為0.2、2、20μg/L時(shí),VTG I基因表達(dá)量分別為對照組的1.64、2.87、41.35倍,濃度增加到200, 2000μg/L時(shí),VTG I的表達(dá)量分別是對照組的13.92和1.31倍(圖1b).除最低暴露組(0.2μg/L)和最高暴露組(2000μg/L),其余各組 VTG I均被顯著誘導(dǎo).

2.2 雌激素合成和代謝酶基因表達(dá)變化

2.2.1 腦垂體性腺軸基因表達(dá)變化 對垂體性腺軸中的15個(gè)基因進(jìn)行了檢測.其中3個(gè)下丘腦促性腺激素釋放激素(cGnRH、mdGnRH、sGnRH)基因[14]和 3個(gè)垂體促性腺激素亞基(GtHα、FSHβ、LHβ)基因[15-16],分別調(diào)控垂體促性腺激素和性腺中性激素的合成分泌.另外,還涉及9個(gè)激素合成相關(guān)基因(StaR、HMGR、CYP11A、CYP11B、CYP17、CYP19A、3β-HSD、17β-HSD I、17β-HSDⅢ).在類固醇激素合成的早期步驟,膽固醇的合成主要由羥甲基戊二酰輔酶 A還原酶(HMGR)這一酶調(diào)控[17].類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)負(fù)責(zé)將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi),啟動類固醇激素的合成[18].CYP11A催化膽固醇生成孕烯醇酮,這是類固醇激素生物合成的起點(diǎn),后經(jīng)3β-HSD酶催化合成孕酮.CYP17酶具有17α-羥化酶和 17,20-裂解酶兩種活性,可分別催化生成17α-羥基孕酮和雄烯二酮,兩個(gè)合成下游雌雄激素的前體物.CYP19A和CYP11B分別調(diào)控雌激素雌二醇(E2)和雄激素 11-酮基睪酮(11-KT)的合成[19-20].17β-HSD I可使雌酮轉(zhuǎn)化為生物活性更高的雌二醇.17β-HSDⅢ為雄激素的代謝酶,使雄烯二酮還原為睪酮[21].該 15個(gè)基因基本涵蓋了整個(gè)垂體性腺軸調(diào)控性激素合成過程[22].本研究通過定量PCR檢測,篩選出顯著受到草甘膦影響的基因,以進(jìn)一步解釋草甘膦雌激素效應(yīng)的分子機(jī)理.

圖2 草甘膦暴露對青鳉魚垂體性腺軸關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響Fig.2 Hypophysial-gonadal axis key genes expression of medaka exposed to glyphosate

結(jié)果顯示,在雌魚中,從低濃度組到高濃度組,腦部 FSHβ mRNA相對表達(dá)量分別為對照組的3.71、1.19、0.87、0.72、0.90 倍.如圖 2a,在 0.2μg/L草甘膦暴露下,雌魚的 FSHβ 表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05),其他各濃度組變化不顯著;性腺CYP19A和17β-HSD I基因相對表達(dá)量分別為對照組的2.16、1.33、1.18、1.42、0.77 倍(圖 2c)和 1.49、1.95、1.19、1.25、0.87倍(圖 2e).CYP19A 基因在 0.2μg/L 草甘膦濃度下,被顯著誘導(dǎo)(P＜0.05),而其他濃度組表達(dá)量相對對照組沒有明顯變化,但隨濃度升高而逐漸下降.17β-HSDI基因在2μg/L草甘膦濃度下被顯著誘導(dǎo)(P＜0.05),在其余各濃度組該基因表達(dá)并沒有顯著變化.

從低濃度組到高濃度組,雄魚腦部 FSHβ mRNA相對表達(dá)量分別為對照組的0.91、1.19、1.85、1.12、1.23倍(圖 2b),但是只有在 20μg/L時(shí),才被顯著誘導(dǎo)(P＜0.05);雄魚 17β-HSDI 基因相對表達(dá)量分別為對照組的2.31、2.90、4.33、7.98、3.08 倍(圖 2f).在 0.2μg/L和 2000μg/L 濃度時(shí),17β-HSD I 表達(dá)量顯著上升(P＜0.05),其余各組中17β-HSD I基因表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢,相對對照組均有2倍以上差異,但并不顯著.

圖3 草甘膦暴露對青鳉魚肝臟中主要雌激素代謝酶CYP1A、CYP1B和CYP3A表達(dá)量的影響Fig.3 Expression of estrogen-related metabolic genes in liver of medaka exposed to glyphosate

2.2.2 雌激素代謝酶基因表達(dá)變化 各濃度組草甘膦暴露均能顯著抑制雌魚體內(nèi)雌激素代謝酶基因的表達(dá)(P＜0.05).CYP1A、CYP1B 和 CYP3A mRNA表達(dá)量,按濃度遞增的順序,分別為對照組的 0.42、0.19、0.27、0.26、0.66 (CYP1A)倍;0.06、0.35、0.15、0.26、0.11(CYP1B)倍和 0.31、0.20、0.23、0.18、0.21(CYP3A)倍(圖 3a、3c 和3e).CYP1A的表達(dá)量,隨著暴露濃度的升高,呈現(xiàn)先降后升的U型變化趨勢,而CYP1B和CYP3A各濃度組的表達(dá)量則相對穩(wěn)定.

如圖3b、3d和3f,從低濃度到高濃度的各暴露組中,雄魚 CYP1A mRNA表達(dá)量分別為對照組的0.38、0.12、0.27、0.17、1.16倍;CYP1B表達(dá)量分別為0.44、0.15、0.36、0.42、2.94倍;CYP3A表達(dá)量分別為0.55、0.32、0.38、0.45、0.70倍.除了CYP1A和CYP1B在最高濃度組表達(dá)量和對照組無顯著差異,雄魚肝臟雌激素代謝酶的表達(dá)在其他濃度組均被顯著抑制(P＜0.05),并且隨著暴露濃度的升高,均呈現(xiàn)出先降后升的U型表達(dá)模式.

3 討論

本研究中,草甘膦暴露能夠顯著誘導(dǎo)雌雄青鳉魚中 VTGI基因的表達(dá),并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(圖1),表明草甘膦具有一定的雌激素效應(yīng).并且雄魚 VTGI基因誘導(dǎo)能力明顯小于雌魚,這與 Bickley等[23]的研究結(jié)果一致,即雌魚對雌激素物質(zhì)較雄魚更加敏感.

Petit等[24]通過酵母雙雜交篩選實(shí)驗(yàn),證明草甘膦本身并不具有雌激素受體結(jié)合活性,Hiroyuki Kojima等[6]利用轉(zhuǎn)染人雌激素受體和雌激素反應(yīng)元件重組質(zhì)粒的中國倉鼠肝細(xì)胞進(jìn)行草甘膦雌激素受體結(jié)合活性實(shí)驗(yàn),也得到相似的結(jié)果.這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明草甘膦并不能直接介導(dǎo)雌激素受體而誘導(dǎo)肝臟 VTG表達(dá).大量文獻(xiàn)[25-27]已經(jīng)證明,魚體內(nèi) VTG 合成主要依賴于血液中雌二醇(17β-E2)濃度水平,并受到 17β-E2的直接調(diào)控,因此為了進(jìn)一步分析草甘膦誘導(dǎo)VTGI表達(dá)的潛在機(jī)理,本研究測定了雌激素合成和代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化.

芳香化酶(CYP19)和 17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSDI)是促進(jìn)性腺雌激素合成的兩個(gè)重要酶,能夠?qū)⒉G酮(Testosterone,T)轉(zhuǎn)化 17β-E2、雌酮(Estrone,E1)轉(zhuǎn)化 17β-E2[28].在草甘膦雌魚2μg/L 暴露組,性腺17β-HSDI顯著表達(dá)(P＜0.05),可能對VTG的上升具有一定貢獻(xiàn).而在脊椎動物中,肝臟細(xì)胞色素450酶(CYP450s)中的CYP1A、CYP1B和CYP3A是將17β-E2代謝為2-羥雌二醇(2-OHE2)的主要酶[29],研究表明,在魚類中,CYP1A在17β-E2代謝中起到的作用更大[30].

結(jié)果顯示,雌魚腦部FSHβ和性腺CYP19A在最低濃度下即被顯著表達(dá)(P＜0.05),而后隨暴露濃度的升高,表達(dá)量呈現(xiàn)降低的趨勢,顯示出與雌魚 VTG相似的表達(dá)模式.這可能是由于腦部 FSH可以提高性腺芳香化酶(CYP19A)的表達(dá)量和活性[31-32],從而增加了性腺雌激素合成,最終導(dǎo)致 VTG合成量升高.另一方面雌魚肝臟雌激素代謝酶,在各暴露濃度組均被顯著抑制(P＜0.05),這種抑制作用與毒死蜱抑制 CYP1A表達(dá)的報(bào)道類似[33-34].

同雌魚相似,雄魚肝臟雌激素代謝酶表達(dá)也被顯著抑制.另外,在 E2代謝過程中起到作用更大的CYP1A,呈現(xiàn)U型的表達(dá)模式,和雄魚VTG基因表達(dá)的倒 U型的劑量效應(yīng)關(guān)系一致.據(jù)Anderson等[35]以虹鱒魚肝細(xì)胞進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)顯示,CYP1A表達(dá)同VTG的合成具有負(fù)相關(guān)性.因此,草甘膦抑制雄魚體內(nèi)雌激素代謝而誘導(dǎo)肝臟VTG基因表達(dá).除了代謝因素,雄魚腦部FSHβ雖然具有和 VTG相同的表達(dá)模式,但性腺CYP19A基因在各濃度組均未有顯著變化.雄魚17β-HSDI在最低和最高兩個(gè)濃度組,均有顯著表達(dá)(P＜0.05),但是這兩組的VTG表達(dá)量并沒有顯著變化,而在 VTG表達(dá)量顯著上升的實(shí)驗(yàn)組,雄魚 17β-HSDI均有兩倍以上的升高,不過由于組內(nèi)差異較大,并沒有顯著性.說明雄魚17β-HSDI在 VTG上升過程中可能并不起關(guān)鍵作用.

4 結(jié)語

一定濃度范圍內(nèi)草甘膦可以誘導(dǎo)青鳉魚VTG 表達(dá),顯示雌激素效應(yīng).并且其雌激素效應(yīng)的誘導(dǎo)機(jī)理在雌雄魚中存在一定的差異.在雌魚體內(nèi)草甘膦通過上調(diào)腦部 FSH表達(dá),誘導(dǎo)CYP19A表達(dá),從而加強(qiáng)了雌激素合成能力.而在雄魚中,則主要通過抑制肝臟雌激素代謝酶(CYP1A 和CYP3A),使體內(nèi)17β-E2濃度升高從而誘導(dǎo)VTG表達(dá)變化.

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